【摘要】：血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的,造成宿主嚴(yán)重病理性損害的人畜共患寄生蟲病。日本血吸蟲尾蚴感染宿主,進(jìn)入宿主體內(nèi)發(fā)育為成蟲,血吸蟲成蟲以合抱形式存在,雌蟲只有與雄蟲合抱才能達(dá)到性成熟,發(fā)育正常。正常發(fā)育雌蟲所產(chǎn)蟲卵堆積在肝門靜脈和腸系膜靜脈,蟲卵分泌的物質(zhì)會(huì)引起宿主肉芽腫反應(yīng),對(duì)宿主造成嚴(yán)重的病理損害,排出體外又會(huì)造成疾病的再傳播;而未與雄蟲合抱的雌蟲呈發(fā)育阻遏狀態(tài),不能正常產(chǎn)卵,因此既不會(huì)對(duì)宿主造成嚴(yán)重危害,也不會(huì)造成血吸蟲病的傳播。本研究利用iTRAQ技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析了18 d、21 d、23 d和25 d的正常發(fā)育雌蟲和發(fā)育阻遏雌蟲的蛋白表達(dá),共鑒定到了19423條肽段,3953個(gè)蛋白質(zhì),差異分析發(fā)現(xiàn)18d正常發(fā)育雌蟲與發(fā)育阻遏雌蟲差異表達(dá)蛋白632個(gè),21d差異表達(dá)蛋白589個(gè),23d差異表達(dá)蛋白705個(gè),25d差異表達(dá)蛋白909個(gè)。MRM技術(shù)被用來驗(yàn)證iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)分析的結(jié)果,MRM結(jié)果表明iTRAQ結(jié)果可靠。對(duì)差異蛋白質(zhì)組結(jié)果進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,GO功能注釋和KEGG通路分析的結(jié)果表明隨著血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育,在正常發(fā)育雌蟲中較多的蛋白參與合成與代謝,翻譯修飾,蛋白質(zhì)折疊和代謝進(jìn)程,在發(fā)育阻遏雌蟲中較多的蛋白參與生物體運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞周期,氧化還原反應(yīng),能量代謝。參與生殖進(jìn)程的蛋白在正常發(fā)育雌蟲中表達(dá)上調(diào)較多,參與解毒相關(guān)的差異蛋白在18d和21d的發(fā)育阻遏雌蟲中只表達(dá)下調(diào),在23d和25d時(shí),參與解毒的差異蛋白總數(shù)增多。在血吸蟲四個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)中,參與結(jié)合和催化活性、翻譯調(diào)節(jié)活性和抗氧化活性的差異表達(dá)蛋白在正常發(fā)育雌蟲中上調(diào)較多。參與KEGG通路的的差異表達(dá)蛋白在四個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)均參與合成和代謝通路最多,且均在正常發(fā)育雌蟲中表達(dá)上調(diào)較多。對(duì)差異蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,差異蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞外基質(zhì),細(xì)胞核和線粒體。本研究克隆并融合表達(dá)了SjLwr基因(Gene Bank登錄號(hào):CAX77005.1),基因序列為501bp,編碼137個(gè)氨基酸。Western blot結(jié)果表明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。利用His鎳柱親和層析法純化重組蛋白,免疫小鼠制備多克隆抗體,免疫組化表明該蛋白定位于蟲體體表和體內(nèi)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果顯示,SjLwr基因在血吸蟲的不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)皆表達(dá),在感染后14d表達(dá)量最高,隨后逐漸下降并趨于穩(wěn)定;其在雄蟲體內(nèi)的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,雌蟲體內(nèi)表達(dá)均高于雄蟲;25d發(fā)育阻遏雌蟲中的表達(dá)高于25d正常發(fā)育雌蟲。通過體內(nèi)RNAi實(shí)驗(yàn)成功篩選出干擾效果較好的S2 siRNA,并使用S2 siRNA進(jìn)行體內(nèi)長(zhǎng)期干擾實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR檢測(cè)干擾效果,發(fā)現(xiàn)RNA干擾明顯抑制了SjLwr基因的表達(dá)。對(duì)長(zhǎng)期干擾蟲體產(chǎn)卵及卵胚孵化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),S2組較NC組減蟲率達(dá)51.37%(P0.05),每只雌蟲肝臟蟲卵負(fù)荷的貢獻(xiàn)率下降15.37%(P0.05),宿主肝臟荷卵數(shù)減少達(dá)43.98%(P0.05),卵胚孵化率減少達(dá)64.95%(P0.01)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn),與NC組相比,S2 siRNA組蟲體體被上白色點(diǎn)狀突出物和泡狀突出物增多,體被組織排列不整齊,且部分組織有破損;雌蟲卵黃細(xì)胞卵黃滴和脂滴減少,細(xì)胞不飽滿,細(xì)胞間隙增大。本研究中,利用iTRAQ技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析,獲得不同時(shí)期正常發(fā)育雌蟲和發(fā)育阻遏雌蟲的蛋白表達(dá)信息,差異表達(dá)蛋白參與了血吸蟲雌蟲生殖發(fā)育的不同進(jìn)程;差異表達(dá)蛋白SjLwr初步的生物學(xué)功能研究也為今后進(jìn)一步研究該蛋白在血吸蟲雌蟲生殖發(fā)育中的作用提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 2-1 光學(xué)顯微鏡觀察雌蟲形態(tài)。21 d，23 d，25 d 正常發(fā)育雌蟲；BDFH：18 d，21 d，23 d，25 d 發(fā)育育雌蟲；E，卵；Ov，卵巢；Vt，卵黃腺；Ic，腸管；Vd，卵黃管。長(zhǎng)為 1 mm。Figure 2-1 Morphological observation of female worm. d, 23 d and 25 d MF; BDFH: 18 d, 21 d, 23 d and 25 d SF. I: 25 d MF; E, vitelline gland; Ic, intestinal canal; Vd, vitelline ducts. The scale length is

圖 2-2 SDS-PAGE 電泳圖。Figure 2-2 The results of SDS-PAGE.解肽段濃度測(cè)定 280 吸收值評(píng)估酶解后肽段的相對(duì)濃度，吸光度值轉(zhuǎn)換為品濃度。酶解后測(cè)定蛋白質(zhì)濃度如表 2-4 所示。表 2-4 酶解后測(cè)定蛋白質(zhì)濃度Table 2-4 Determination of protein concentration after enzymatic hydrolys樣品名 濃度(μg/uL) 體積(μL) 蛋白總量(μg18 d MF 0.57 330.00 188.0721 d MF 0.57 330.00 188.6723 d MF 0.61 330.00 200.5125 d MF 0.91 330.00 300.98
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.735

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本文編號(hào)：2691324