發(fā)布時(shí)間：2020-06-01 08:56

【摘要】：豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染引起的一種以咳嗽、氣喘為主要癥狀的慢性、消耗性呼吸道傳染病,給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失�，F(xiàn)階段大部分豬場(chǎng)使用Mhp滅活疫苗,還有部分豬場(chǎng)使用弱毒疫苗來控制MPS,但存在免疫效果不佳、價(jià)格高昂、使用不便等問題,因而研發(fā)高免疫保護(hù)力且便于使用的疫苗對(duì)于防控該病具有重要的意義。1鑒定豬肺炎支原體血清體液免疫顯性蛋白ELISA方法的建立Mhp366是一種能夠在Mhp自然感染條件下刺激宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈體液免疫的蛋白,能與Mhp恢復(fù)期血清發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng),而不與Mhp滅活疫苗高免血清發(fā)生反應(yīng)。將pGEX-6P-1-mhp366重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),構(gòu)建重組菌GST-Mhp366,誘導(dǎo)表達(dá)Mhp366蛋白。將GST-Mhp366重組菌和GST工程菌裂解液加入谷胱甘肽包被板進(jìn)行抗原包被,分別與11份Mhp恢復(fù)期血清和7份Mhp陰性血清反應(yīng),通過對(duì)抗原包被量、封閉液條件、血清(Mhp恢復(fù)期血清和Mhp陰性血清)和二抗稀釋度進(jìn)行優(yōu)化,最終確定GST-Mhp366重組菌和GST工程菌裂解液原液為抗原的最佳包被濃度,PBS+10%FBS+2.5%脫脂奶粉為最佳封閉液,分別將血清按照1:500稀釋、HRP標(biāo)記兔抗豬IgG酶標(biāo)二抗按照1:40 000稀釋為最佳血清和二抗工作濃度,從而建立了鑒定豬肺炎支原體血清體液免疫顯性蛋白的ELISA方法。2豬肺炎支原體血清體液免疫顯性蛋白的篩選鑒定利用生物信息學(xué)方法篩選到20個(gè)普遍存在于Mhp菌株中的保守蛋白:Mhp153、Mhp156、Mhp228、Mhp252、Mhp265、Mhp322、Mhp336、Mhp351、Mhp364、Mhp379、Mhp390、Mhp424、Mhp472、Mhp483、Mhp504、Mhp511、Mhp535、Mhp623、Mhp677和Mhp682。這些蛋白對(duì)應(yīng)的基因連接p GEX-6P-1載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)/XL-1 Blue,誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。用誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的20個(gè)重組菌裂解液和GST工程菌裂解液原液包被谷胱甘肽板,PBS+10%FBS+2.5%脫脂奶粉封閉,分別將血清(11份Mhp恢復(fù)期血清和7份Mhp陰性血清)按照1:500稀釋、HRP標(biāo)記兔抗豬IgG酶標(biāo)二抗按照1:40 000稀釋,進(jìn)行ELISA反應(yīng)。共篩選出10個(gè)Mhp血清體液免疫顯性蛋白,分別為Mhp153、Mhp156、Mhp336、Mhp364、Mhp379、Mhp424、Mhp472、Mhp535、Mhp623和Mhp677。3鑒定區(qū)分豬肺炎支原體滅活疫苗免疫和自然感染的血清體液免疫顯性蛋白ELISA方法的建立將GST-Mhp366重組菌和GST工程菌裂解液原液加入谷胱甘肽包被板進(jìn)行抗原包被,以PBS+10%FBS+2.5%脫脂奶粉封閉,分別與11份Mhp恢復(fù)期血清和7份Mhp滅活疫苗高免血清反應(yīng),通過對(duì)血清(Mhp恢復(fù)期血清和Mhp滅活疫苗高免血清)和二抗稀釋度進(jìn)行優(yōu)化,確定將血清按照1:500稀釋、HRP標(biāo)記兔抗豬IgG酶標(biāo)二抗按照1:20 000稀釋作為最佳工作濃度,建立了鑒定區(qū)分豬肺炎支原體滅活疫苗免疫和自然感染血清體液免疫顯性蛋白的ELISA方法。4鑒定區(qū)分豬肺炎支原體滅活疫苗免疫和自然感染的血清體液免疫顯性蛋白的篩選鑒定用已經(jīng)篩選到的10個(gè)Mhp血清體液免疫顯性蛋白的重組菌裂解液原液和GST工程菌裂解液原液包被谷胱甘肽板,PBS+10%FBS+2.5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉,分別將11份Mhp恢復(fù)期血清和7份Mhp滅活疫苗高免血清按1:500稀釋、HRP標(biāo)記兔抗豬IgG酶標(biāo)二抗按1:20 000稀釋,進(jìn)行ELISA反應(yīng)。最終鑒定出1個(gè)區(qū)分豬肺炎支原體滅活疫苗免疫和自然感染的血清體液免疫顯性蛋白Mhp336,從而為豬肺炎支原體基因工程亞單位疫苗的研發(fā)提供抗原靶標(biāo)。
【圖文】：

質(zhì)粒的雙酶切鑒定inant plasmid pGEX-6P-1-mhp366 by double enzymeested with BamH Ι and Xho Ι. GST 蛋白的原核表達(dá)與純化菌經(jīng) 1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)后，超聲破 SDS-PAGE 電泳后可見在 90 kDa 和 ）。90 kDa 處為 GST 與 Mhp366 融合為 GST 蛋白。融合蛋白經(jīng) PreScission圖 2，Lane 2、3、4、5），比預(yù)期蛋瓊脂糖珠-融合蛋白復(fù)合物中仍有未GST 蛋白和 46 kDa 的 PreScission Pro特異結(jié)合在谷胱甘肽瓊脂糖珠的雜蛋

重組蛋白表達(dá)純化及酶切結(jié)果 protein GST-Mhp366 was purified by Glutathione SepharoseTM4B and dn molecular weight marker; 1: the supernatant was harvested after the cleally washed three times with PBS; 6: the remaining bead sample after digesISA 反應(yīng)條件的確定原包被濃度的選擇366 和 GST 細(xì)菌裂解液分別按原液、1:5、1:10 比例稀 7 份 Mhp 陰性血清反應(yīng)，分別計(jì)算在各個(gè)抗原包細(xì)菌裂解液和 GST 細(xì)菌裂解液與每份陰性血清反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）（表 5）。濃度包被時(shí)，，GST-Mhp366 細(xì)菌裂解液和 GST 細(xì)菌裂解液分值之差及相應(yīng)的 X、SD 和 X+2SDerence of OD630value, X, SD and X+2SD that the GST-Mhp366 lh different concentration were reacted with 7 negative sera陰性陰性陰性陰性陰性陰性平均
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S859.797

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳財(cái);華利忠;甘源;徐飛揚(yáng);袁廳;吳猛;吳其亮;高昆;邵國青;;豬支原體肺炎凈化研究進(jìn)展[J];中國動(dòng)物保健;2014年11期

2 劉楠;李小妮;牛聰穎;;疫苗研究新進(jìn)展——反向疫苗學(xué)[J];中國醫(yī)藥指南;2011年16期

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4 金洪效,毛洪先,邵國青,樊素琴,夏慶鳳;豬氣喘病弱毒凍干菌苗免疫性能測(cè)試[J];中國獸醫(yī)科技;1990年02期

5 李繼庚,王桂敏,丁慶猷,王紹華,周泰沖;豬喘氣病弱毒疫苗的研究——豬肺炎霉形體兔化弱毒株的培育[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);1989年04期

本文編號(hào)：2691248