【摘要】：豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌(Actinobacillus pleuropneumoinae,APP),原稱(chēng)胸膜肺炎嗜血桿菌,易引起豬呼吸道疾病傳染性胸膜肺炎,不同年齡段的豬都有易感性且死亡率較高。隨著國(guó)內(nèi)動(dòng)物抗生素的濫用,一些治療該疾病的藥物的治療效果已經(jīng)大大降低,所以需要我們通過(guò)合理的用藥來(lái)減少耐藥性的產(chǎn)生。頭孢噻呋是第一個(gè)用于動(dòng)物的第三代頭孢類(lèi)抗生素,對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌均有效,對(duì)動(dòng)物呼吸道細(xì)菌具有良好的臨床治療效果。為了降低豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌對(duì)頭孢噻呋的耐藥性的產(chǎn)生,需要我們對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌開(kāi)展耐藥監(jiān)控措施。通過(guò)建立豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌對(duì)頭孢噻呋的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn),能夠有效科學(xué)的對(duì)耐藥進(jìn)行監(jiān)控。本課題通過(guò)測(cè)定頭孢噻呋對(duì)135株豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的藥物敏感性,建立了野生型臨界值:檢測(cè)體外和半體內(nèi)條件下頭孢噻呋對(duì)臨床分離的致病性菌株的抗菌作用,研究頭孢噻呋在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué),建立PK-PD模型,制定出最佳的給藥方案,建立藥效學(xué)臨界值。研究頭孢噻呋對(duì)不同MIC致病性菌株所致感染疾病的治療效果,建立頭孢噻呋對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的臨床臨界值,制定頭孢噻呋對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),為豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的耐藥提供合理的科學(xué)的判定依據(jù)。1.頭孢噻呋對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的藥效學(xué)研究及野生型臨界值的制定采用瓊脂稀釋法測(cè)定頭孢噻呋對(duì)135株臨床分離的豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的藥物敏感性,通過(guò)ECOFFinder軟件分析最低抑菌濃度(MIC)分布。然后用微量肉湯稀釋法測(cè)定頭孢噻呋在TSB肉湯培養(yǎng)基和豬血漿中對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌BW39菌株的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度(MBC),同時(shí)在體外條件下測(cè)定頭孢噻呋對(duì)BW39菌株的最小防突變濃度(MPC)以及抗菌后效應(yīng)(PAE),在含有不同濃度頭孢噻呋的培養(yǎng)基和豬血漿中進(jìn)行體外和半體內(nèi)殺菌曲線(xiàn)的測(cè)定。頭孢噻呋對(duì)135株豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的MIC分布范圍在0.0075-4 μg/mL之間,MIC50和MIC90分別為0.015 μg/mL和0.5μg/mL,制定的野生型臨界值為0.125μg/mL。體外和半體內(nèi)條件下頭孢噻呋對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌BW39的MIC分別為0.5 μg/mL 和 1 μg/mL,MBC 均為 1 μg/mL,MPC 為 1.6 μg/mL,耐藥突變選擇窗(MSW)為0.5-1.6μg/mL,頭孢噻呋與豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌暴露1 h產(chǎn)生的PAE為0.33-0.66 h,暴露2 h產(chǎn)生的PAE為0.73-1.17 h。體外和半體內(nèi)殺菌曲線(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果均顯示頭孢噻呋對(duì)BW39菌株的抗菌作用類(lèi)型為時(shí)間依賴(lài)型。2.頭孢噻呋在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究及藥效學(xué)臨界值的制定試驗(yàn)選取12頭體重15 kg左右的健康斷奶二元雜交仔豬,隨機(jī)分為2組,每組6頭。對(duì)健康組和患病組均按照5 mg/kg·b.w劑量肌肉注射鹽酸頭孢噻呋。給藥后于不同時(shí)間點(diǎn)采集血漿,采用高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)藥物濃度。通過(guò)半體內(nèi)PK-PD模型擬合以及劑量計(jì)算公式,制定出最佳的給藥方案。同時(shí)利用蒙特卡羅模擬方法對(duì)藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬分析,得到藥效學(xué)臨界值。根據(jù)藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)選擇最佳的PK-PD參數(shù),構(gòu)建頭孢噻呋對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的半體內(nèi)PK-PD模型,通過(guò)Sigmoid Emax模型方程對(duì)半體內(nèi)殺菌曲線(xiàn)中AUC/MIC值和細(xì)菌對(duì)數(shù)變化量之間的關(guān)系進(jìn)行擬合,計(jì)算得到健康組中抑菌、殺菌、清除效果下的AUC/MIC值分別為45.73、63.83、69.04 h,患病組中抑菌、殺菌、清除效果下的AUC/MIC值分別為38.94、47.23、49.16 h。通過(guò)劑量計(jì)算公式得到健康組和患病組預(yù)防、治療、根治目的下的劑量分別為2.2、3.0、3.3 mg/kg·b.w和1.8、2.2、2.3 mg/kg·b.w。利用蒙特卡羅方法對(duì)AUC的均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行模擬,得到頭孢噻呋對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的藥效學(xué)臨界值為2 μg/mL。3.頭孢噻呋對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌臨床臨界值及耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)的制定將36頭仔豬隨機(jī)分為6組,1組為陰性對(duì)照組,5組為藥物治療組,每組6頭。選擇具有致病力的5株不同MIC豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌進(jìn)行攻毒試驗(yàn),建立人工感染患病模型。不同菌株攻毒的豬只進(jìn)行治療,統(tǒng)計(jì)治愈率和死亡率,利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)算法WindoW和CART模型以及非線(xiàn)性回歸分析,制定臨床臨界值。根據(jù)折點(diǎn)制定樹(shù)狀圖,建立頭孢噻呋對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)。選擇編號(hào)為 BW9,BW29,BW39,QG17 和 18119,MIC 分別為 0.015 μg/mL、0.125μg/mL、0.5 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL的5株豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌分別對(duì)試驗(yàn)組進(jìn)行攻毒,然后對(duì)感染仔豬進(jìn)行肌肉注射頭孢噻呋3mg/kg.b.w,一天一次,連續(xù)三天的給藥治療,得到頭孢噻呋對(duì)上述5株菌株的治愈率分別為100%、83%、83%、67%和50%,通過(guò)WindoW和CART算法分析模型確定臨床臨界值的分布范圍為0.5-1.25μg/mL,最后通過(guò)非線(xiàn)性回歸分析方法,制定頭孢噻呋對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的臨床臨界值為0.5-1.25 μg/mL。結(jié)合獲得的野生型臨界值、藥效學(xué)臨界值和臨床臨界值,最終建立豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌對(duì)頭孢噻呋的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)為0.5-1.25 μg/mL。本課題參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)和歐洲藥敏試驗(yàn)聯(lián)合委員會(huì)(EUCAST)組織公布的標(biāo)準(zhǔn)程序,建立了豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌對(duì)頭孢噻呋的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)。為豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的耐藥監(jiān)控提供科學(xué)的理論依據(jù),有利于保護(hù)和維持頭孢噻呋在臨床治療中的有效性。
【圖文】：

耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)又稱(chēng)折點(diǎn)或者解釋標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)定義細(xì)菌對(duì)抗菌藥物是否敏感，最小抑菌濃度（ＭＩＣ）或者抑菌圈直徑（ｍｍ）來(lái)表示。ＣＬＳＩ邋（Ｓｔａｓｓ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００５）將敏感性折點(diǎn)（Ｓ），中介（Ｉ）和耐藥（Ｒ），歐盟則分為敏感或者耐藥。根據(jù)ＣＬＳＩ０－Ｓ１７給出的定義：敏感是指通過(guò)正常的給藥劑量，，藥物在血漿或者靶組抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，中介是指在給藥后，藥物在血漿或者靶組織中藥物對(duì)細(xì)抑制速度相對(duì)于敏感細(xì)菌生長(zhǎng)更慢一些，耐藥是指在藥物在血漿或者靶組的生理藥物濃度不能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。逡逑國(guó)際上折點(diǎn)的制定主要包括三個(gè)部分，即野生型臨界值（ＣＯｗｒ／ＥＯＦＦｓ），藥／藥效臨界值（ＣＯＰＤ），臨床臨界值（Ｃ0ａ＿），最終通過(guò)人用藥物耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)生型臨界值，藥動(dòng)學(xué)臨界值，臨床臨界值來(lái)確定最終的折點(diǎn)值，判定方法

３．邋１．邋１豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌ＰＣＲ鑒定逡逑豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌通過(guò)擴(kuò)增特異性基因核苷酸序列ＩＶ毒素基因進(jìn)行特異性逡逑鑒定，特異性鑒定結(jié)果見(jiàn)圖２。本試驗(yàn)選擇擴(kuò)增的條帶為３７７邋ｂｐ。如圖所示，在５００逡逑ｂｐ到２５０邋ｂｐ間只有豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，表明所選引物為豬胸逡逑膜肺炎放線(xiàn)桿菌的特異性引物，可用于豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的ＰＣＲ特異性鑒定。逡逑圖２豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌ＰＣＲ鑒定條帶逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｉ邋Ａｃｔｉｎｏｈａｃｉｌｌｕｓ邋ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｒｎｏｉｎａｅ逡逑注：Ｍ邋為邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，從下到上的條帶依次邋２０００邋ｂｐ，１０００邋ｂｐ，７５０邋ｂｐ．邋５００邋ｂｐ，邋２５０邋ｂｐ，１００邋ｂｐ；陽(yáng)為陽(yáng)性逡逑對(duì)照；陰為陰性對(duì)照．逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｍ邋ｉｓ邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，邋ｔｈｅ邋ｂａｎｄ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｂｏｔｔｏｍ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｔｏｐ邋ｉｓ２０００邋ｂｐ，邋１０００邋ｂｐ，邋７５０邋ｂｐ．邋５００邋ｂｐ，邋２５０邋ｂｐ．邋１００逡逑ｂｐ；邋“陽(yáng)”邋ｉｓ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋“陰”邋ｉｓ邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑３．邋１．２敏感性測(cè)定結(jié)果逡逑采用ＣＬＳＩ推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定頭孢噻呋對(duì)１３５株豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的逡逑ＭＩＣ。其中質(zhì)控菌株大腸桿菌ＡＴＣＣ２５９２２的ＭＩＣ結(jié)果為０．５－ｌ＾ｇ／ｍＬ，在質(zhì)控范圍逡逑０．２５－１邋ｐｇ／ｍＬ之內(nèi)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：2691158