【摘要】：雞球蟲病是由一種或數(shù)種艾美耳球蟲寄生于雞消化道上皮細(xì)胞內(nèi)引起的一種寄生原蟲病,嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè),在我國每年僅用于該病的防治費(fèi)用就達(dá)3～6億元。長期以來,該病的防治主要依賴藥物。但隨著藥物的長期使用,引起耐藥性蟲株普遍出現(xiàn),使藥物防治效果不斷下降。此外,抗球蟲藥在飼料中的長期添加,還導(dǎo)致藥物殘留肉蛋,污染環(huán)境,危害人類健康。因此,迫切需要尋找新的策略或方法來控制雞球蟲病。毒害艾美耳球蟲(Eimeria necatrix)是7種雞球蟲中致病性最強(qiáng)的球蟲之一,主要危害8～18周齡的雞,引起急性小腸球蟲病。艾美耳球蟲的生活史包括裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三個(gè)發(fā)育階段,裂殖生殖又有不同的繁殖代數(shù)。一般認(rèn)為艾美耳球蟲的生長發(fā)育與性別分化受制于不同發(fā)育階段的基因差異表達(dá)與調(diào)控。球蟲各階段蟲體的分離純化很難,因此也制約了球蟲分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展。艾美耳球蟲發(fā)育的相關(guān)研究國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道很少,尤其是有關(guān)毒害艾美耳球蟲的不同發(fā)育階段的分子學(xué)研究國內(nèi)外尚無有關(guān)報(bào)道。毒害艾美耳球蟲的裂殖生殖包括三代,第一、二代裂殖生殖發(fā)生在小腸中段的腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi),第三代裂殖生殖和配子生殖發(fā)生在盲腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi),易于蟲體鑒別與分離。本文分離與純化了毒害艾美耳球蟲的第二、三代裂殖子和配子體,提取總RNA后采用第二代測(cè)序技術(shù)分別對(duì)這3個(gè)發(fā)育階段蟲體的mRNA進(jìn)行測(cè)序,獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù);對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析,篩選不同發(fā)育階段蟲體的差異表達(dá)基因,并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證、功能注釋與代謝通路富集分析;最后,對(duì)4個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行原核表達(dá)與免疫熒光定位,對(duì)其中1個(gè)重組蛋白進(jìn)行了動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)。本文通過毒害艾美耳球蟲第二、三代裂殖子和配子體3個(gè)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和比對(duì)分析,獲得了3個(gè)發(fā)育階段的差異表達(dá)基因,而對(duì)艾美耳球蟲不同發(fā)育階段差異表達(dá)基因的研究,不僅可以解析艾美耳球蟲生長發(fā)育的的分子基礎(chǔ)與機(jī)制,而且可能尋找到藥物或疫苗免疫的靶點(diǎn),從而為雞球蟲病的防治提供新途徑和新方法。一、毒害艾美耳球蟲第二、三代裂殖子和配子體的分離與純化用毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊經(jīng)嗉囊接種無球蟲感染雛雞后,從雞小腸中段黏膜組織中分離第二代裂殖子,最后采用Percoll密度梯度離心法純化裂殖子,平均每只雞獲得7.25×108個(gè)裂殖子;從雞盲腸黏膜組織中分離第三代裂殖子,最后采用DEAE-52纖維素柱層析法純化裂殖子,平均每只雞獲得0.6×107個(gè)裂殖子。通過外科手術(shù)經(jīng)盲腸直接接種第二代裂殖子后30 h,從雞盲腸黏膜組織中分離配子體,最后采用Percoll密度梯度離心法純化配子體,平均每只雞獲得0.5×108個(gè)配子體。二、毒害艾美耳球蟲第二、三代裂殖子與配子體的轉(zhuǎn)錄組分析分別提取毒害艾美耳球蟲第二、三代裂殖子和配子體的RNA,構(gòu)建測(cè)序樣本文庫,進(jìn)行高通量測(cè)序。分別從第二代裂殖子文庫、第三代裂殖子文庫和配子體文庫中獲得68009 332,51 854 332,73 219 844條Raw reads。比對(duì)后,第二代裂殖子共有6 977個(gè)基因注釋成功,第三代裂殖子有6 901個(gè)基因注釋成功,配子體有7983個(gè)基因注釋成功�；虻谋磉_(dá)分析顯示,7 137個(gè)基因在3個(gè)階段均有表達(dá),71個(gè)基因僅在第二代裂殖子表達(dá),61個(gè)基因僅在第三代裂殖子表達(dá),340個(gè)基因僅在配子體表達(dá)。GO分析顯示在3個(gè)發(fā)育階段基因富集的GO條目數(shù)相近,僅在條目中的基因數(shù)有所不同。KEGG分析顯示3個(gè)階段的通路有所不同,第二代裂殖子的基因主要參與剪接體、核糖體、的合成、蛋白酶體、DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路;第三代裂殖子的基因主要參與剪接體、核糖體合成、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA降解、RNA聚合酶等;配子體的基因主要參與核糖體的合成、HIF-1信號(hào)通路、剪接體、突觸囊泡循環(huán)、溶酶體、磷酸戊糖途徑等。三、毒害艾美耳球蟲第二、三代裂殖子比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析比較分析每個(gè)轉(zhuǎn)錄本在第二代裂殖子和第三代裂殖子的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)2 053個(gè)基因表達(dá)顯著差異,其中第二代裂殖子顯著上調(diào)表達(dá)基因1 216個(gè),特異性表達(dá)基因95個(gè);第三代裂殖子顯著上調(diào)表達(dá)基因837個(gè),特異性表達(dá)基因48個(gè)。GO分析顯示中有1 203個(gè)差異表達(dá)基因被成功注釋到59個(gè)GO條目,GO富集分析中有1 091個(gè)差異表達(dá)基因富集在243個(gè)GO條目。KEGG分析顯示,620個(gè)差異表達(dá)基因被成功注釋到198條信號(hào)通路,727個(gè)差異表達(dá)基因富集到242條信號(hào)通路。四、毒害艾美耳球蟲第三代裂殖子與配子體比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析比較分析每個(gè)轉(zhuǎn)錄本在第三代裂殖子和配子體的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)4 267個(gè)基因表達(dá)顯著差異,其中第三代裂殖子顯著上調(diào)表達(dá)基因1 478個(gè),特異性表達(dá)基因329個(gè);第三代裂殖子顯著上調(diào)表達(dá)基因2 789個(gè),特異性表達(dá)基因1 289個(gè)。差異表達(dá)基因的GO分析顯示,1 295個(gè)被成功注釋到57個(gè)GO條目。KEGG分析顯示,620個(gè)差異表達(dá)基因被成功注釋到198條信號(hào)通路。富集分析顯示,725個(gè)顯著差異表達(dá)基因富集到241條信號(hào)通路。五、差異表達(dá)基因的原核表達(dá)及免疫熒光定位分析根據(jù)熒光定量PCR的驗(yàn)證結(jié)果,選擇4個(gè)差異表達(dá)基因(EnPIPK、En4GC、EnCK2、EnHAP2),人工合成或應(yīng)用RT-PCR方法克隆基因序列,并分別用原核表達(dá)載體pET28a(+)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,誘導(dǎo)表達(dá)。融合蛋白的大小分別為30 kDa、17kDa、20 kDa、20kDa左右,均以包涵體的形式存在為主。Western blot檢測(cè)顯示,4種重組蛋白均能識(shí)別抗6×HIS標(biāo)簽單抗。分別用4種重組蛋白免疫小鼠制備的多抗進(jìn)行免疫免疫熒光定位試驗(yàn),結(jié)果顯示EnPIPK、EnCK2和EnHAP2基因表達(dá)產(chǎn)物定位在第二代裂殖子(或裂殖子體)、第三代裂殖子(或裂殖體)和配子體,但在3個(gè)發(fā)育階段表現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不盡一致;EnAGC基因表達(dá)產(chǎn)物僅見于第三代裂殖子(或裂殖體)和配子體。免疫免疫熒光定位與熒光定量PCR結(jié)果相一致。六、重組蛋白rEnHAP2免疫保護(hù)效果將純化復(fù)性的重組蛋白rEnHAP2按不同劑量(200、100、50μg/羽)免疫無球蟲感染雛雞,免疫2次后除未免疫未攻蟲組外,其余各試驗(yàn)組雛雞均感染毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊,以成活率、卵囊減少率、病變記分、平均增重等為指標(biāo),評(píng)價(jià)重組蛋白的免疫保護(hù)效果,并檢測(cè)其誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá)水平。試驗(yàn)共進(jìn)行2次。結(jié)果顯示,rEnHAP2以每雞200 μg的免疫劑量保護(hù)效果最好,與未免疫攻蟲組相比,重組蛋白rEnHAP2能降低卵囊產(chǎn)量與病變記分,提高存活率;能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞免疫和體液免疫。
【圖文】：

宿世杰：毒害艾美耳球蟲３個(gè)發(fā)育階段的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研宄與差異表達(dá)基因的克隆表達(dá)和功能鑒定邐３７逡逑現(xiàn)配子體純度高（圖１－３），，計(jì)數(shù)每只雞大約獲得０．５ｘｌ0８個(gè)蟲體。通過盲腸體外接種第逡逑二代裂殖子的方法不僅解決了發(fā)育的不同步性，而且大大增加了配子體的數(shù)量和密度。逡逑＞、心邋￥邐兔、…＇邋＜，邐備，邐《逡逑＿畫＿

本文編號(hào)：2690829