發(fā)布時間：2020-06-01 01:39

【摘要】：乙型腦炎病毒(JEV)是流行性乙型腦炎的病原體。本研究旨在進行JEV關(guān)鍵毒力位點分析、鑒定E-I176R(E蛋白第176位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)榫彼?突變位點能否影響其神經(jīng)毒力。首先,分析預(yù)測了JEV神經(jīng)毒力相關(guān)突變位點6個。在進行了JEV SCYA201201-1與SCYA201201-0901毒株的全基因序列測定的基礎(chǔ)上,進行了其神經(jīng)毒力的鑒定,分析獲得了JEV神經(jīng)毒力相關(guān)氨基酸突變位點6個:E蛋白A72T、I176R、S251Y、E273K,NS2B蛋白V44A和NS4A蛋白G168E。其次,成功拯救了JEV E-I176R單點突變病毒。利用定點突變和反向遺傳操作方法構(gòu)建并包裝了JEV E-I176R單點突變病毒,利用蝕斑形成試驗、PCR、序列測定等方法對包裝的病毒進行了鑒定,在BHK-21細胞進行了體外生長特性的研究,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)點突變對JEV的蝕斑形成特性與生長曲線沒有顯著影響。最后,闡明了乙型腦炎病毒E-I176R突變位點能夠顯著降低其神經(jīng)毒力。將84只小鼠平均分為14組進行神經(jīng)毒力實驗,每個病毒滴度重復(fù)3次進行驗證,發(fā)現(xiàn)200與2000PFU的未突變病毒引起小鼠的死亡率分別為55.56%與88.89%,而200與2000PFU的E-I176R單點突變病毒引起小鼠的死亡率分別為11.11%與50%。熒光定量檢測結(jié)果顯示,未突變病毒在鼠腦內(nèi)含量在攻毒后3、5、7天逐漸升高,而E-I176R單點突變病毒在3、5、7天保持穩(wěn)定。本研究分析出了6個JEV神經(jīng)毒力相關(guān)氨基酸突變位點,證實了E-176為影響乙腦病毒毒力的關(guān)鍵位點,E-I176R單點突變能夠能顯著降低其神經(jīng)毒力。本研究為乙腦病毒致弱機制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

2.1.3 病毒神經(jīng)毒力的測定將 SPF 三周齡雌性小鼠以 6 只為一組于動物房中飼養(yǎng)一天，將已測病毒滴度的SCYA201201-1 與 SCYA201201-0901 病毒液 10 倍梯度稀釋至 10~107PFU/ml 濃度備用使用微量注射器以 30ul 的劑量對小鼠進行腦內(nèi)接種，每個濃度接種一組小鼠，持續(xù)觀察小鼠有無出現(xiàn)神經(jīng)癥狀 21 天，，記錄每日小鼠死亡數(shù)。2.1.4 序列比對分析使用DNAMAN軟件分析SCYA201201-1與SCYA201201-0901乙腦毒株全長核苷酸序列與編碼的氨基酸，并與一株 I 型弱毒株 Mie/41/2002 (GenBank 登錄號：AB241119)，兩株 I型強毒株 HEN0701 (GenBank 登錄號：FJ495189)與 SX09S-01 (GenBankno 登錄號HQ893545) 進行比對。2.2 乙腦 E-I176R 點突變感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2.6 載體連接計算膠回收得到的感染性克隆載體片段和點突變 E 基因片段濃度，按照 1:3,1:5,1:7的濃度計算加入的核酸體積，使用 DNA 連接專用的試劑盒連接操作。具體連接反應(yīng)體系如下表所示（表 8）。表 8 T4 DNA 連接酶反應(yīng)體系Table 8 T4 DNAligase reaction volume試劑名稱 體積（μl）乙腦 E 基因目的片段膠回收溶液 3.0乙腦感染性克隆低拷貝載體膠回收溶液 1.0T4 連接酶 1.02×T4 Buffer 5.0總體積 10.0反應(yīng)溫度 16℃，過夜進行連接反應(yīng)后，于 4℃冰箱中保存。2.3 乙腦 E-I176R 點突變病毒的包裝
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 董少忠;口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗神經(jīng)毒力試驗新方法[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1997年06期

2 韓大真;谷氨酸的神經(jīng)毒力作用[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);1988年02期

3 李虹;;Ⅰ和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin疫苗株間的重組病毒可作為候選Ⅲ型活疫苗株[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1989年04期

4 賴眾;;脊髓灰質(zhì)炎病毒的無神經(jīng)毒力、遺傳穩(wěn)定性克隆(Sabin Ⅲ型疫苗株)[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1989年06期

5 周激文;;評定脊髓灰質(zhì)炎活疫苗神經(jīng)毒力的形態(tài)測定法[J];國外醫(yī)學(xué).生物制品分冊;1980年04期

6 李杰,米山徹夫,張禮壁,侯曉輝,鄭紅,方勇,原稔,荻原昭夫;中國脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株基因特征及其神經(jīng)毒力的初步觀察[J];病毒學(xué)報;1997年03期

7 李虹;與口服Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎減毒疫苗基因組非編碼區(qū)一個核苷酸改變有關(guān)的神經(jīng)毒力增強[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1986年05期

8 郭仁,陳淑范,羅其勝,王慶玲,易紅昆,詹瓊芬;轉(zhuǎn)基因小鼠用作脊髓灰質(zhì)炎活疫苗神經(jīng)毒力實驗動物模型的研究[J];動物學(xué)研究;1999年04期

9 郭仁,陳淑范,羅其勝,王慶玲,易紅昆,詹瓊芬;應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠作為脊髓灰質(zhì)炎活疫苗神經(jīng)毒力實驗動物模型的研究[J];中國生物制品學(xué)雜志;1999年03期

10 李長貴,周鐵群;腮腺炎疫苗神經(jīng)毒力試驗的評價[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2000年04期

相關(guān)會議論文 前8條

1 趙衛(wèi);范寶昌;胡志君;陳水平;王鵬程;李曉萸;于曼;秦鄂德;楊佩英;;我國登革2型病毒毒力的多位點控制[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

2 李尤;顏富強;劉斌;;猴體神經(jīng)毒理試驗方法[A];2013年（第三屆）中國藥物毒理學(xué)年會暨藥物非臨床安全性評價研究論壇論文摘要[C];2013年

3 屈哲;呂建軍;林志;霍桂桃;楊艷偉;張

本文編號：2690771