【摘要】：隨著乳制品消費水平的不斷提高,人們越來越關(guān)注牛奶的質(zhì)量。奶牛乳腺炎已經(jīng)成為嚴重影響牛乳品質(zhì)的重要因素,抗生素是比較有效的治療手段,但抗生素帶來的負效應(yīng)日益凸顯,病原菌耐藥性增強、牛乳中抗生素殘留等眾多問題,導致奶牛產(chǎn)奶量降低和生乳品質(zhì)下降。因此,研發(fā)新型可替代抗生素的產(chǎn)品,對于提升牧場經(jīng)濟效益、提高牛乳品質(zhì)具有重大意義。本研究通過RT-PCR、同源重組等技術(shù)構(gòu)建奶牛溶菌酶基因(Lyz)/氣管抗菌肽基因(TAP)乳腺特異性表達質(zhì)粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到奶牛的原代乳腺上皮細胞和泌乳高峰期的小鼠中,通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白,熒光定量PCR和Western Blot檢測技術(shù)驗證上述質(zhì)粒在乳腺上皮細胞水平和乳腺組織水平的特異性表達。通過細胞功毒實驗分析表達產(chǎn)物抗菌效果,通過小鼠負重實驗、耐缺氧實驗、體重變化稱量、血液生化指標和臟器指數(shù)評估重組質(zhì)粒的安全性。旨在通過重組質(zhì)粒實現(xiàn)奶牛溶菌酶、氣管抗菌肽內(nèi)源抗菌物質(zhì)在乳腺組織的特異性表達,提高奶牛自身的免疫力,以達到防治乳腺炎和提高原料奶質(zhì)量的目的。主要研究結(jié)果如下:1治療奶牛乳腺炎表達質(zhì)粒的構(gòu)建通過RT-PCR從牛乳腺上皮細胞擴增Lyz、TAP基因編碼序列,將其克隆到攜帶增強型綠色熒光蛋白通用型表達載體pEGFP-N1中,利用同源重組技術(shù),以奶牛乳腺特異性表達β-乳球蛋白基因(BLG)啟動子替換pEGFP-N1載體原有CMV啟動子,構(gòu)建了奶牛溶菌酶基因(Lyz)/氣管抗菌肽基因(TAP)乳腺特異性表達質(zhì)粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,奶牛溶菌酶基因(LLz)、氣管抗菌肽基因(TAP)和β-乳球蛋白基因(BLG)啟動子序列,PCR擴增出與預(yù)期片段長度匹配的條帶,且菌液PCR檢測顯示,每個目的片段均連接到增強型綠色熒光蛋白通用型表達載體pEGFP-N1中的所需位置。BLG基因啟動子克隆測序后,通過BLAST比對發(fā)現(xiàn),克隆的啟動子序列與數(shù)據(jù)庫中該基因5'上游相似性達99%。分析該片段,分別在第887bp-892bp、1188bp-1191bp、2080-2085bp位置存在GC-box、CAAT-box和TATA-box的啟動子元件,表明所選片段為BLG基因的啟動子片段。重組質(zhì)粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP測序結(jié)果顯示與目的片段長度相符,目的基因閱讀框正確,未出現(xiàn)錯誤位置。2重組質(zhì)粒細胞表達活性及抗菌效果采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP分別轉(zhuǎn)染至奶牛原代乳腺上皮細胞(bPMEC)和人腎臟上皮細胞(HEK293T),熒光顯微鏡觀察到只有奶牛原代乳腺上皮細胞在轉(zhuǎn)染兩種重組質(zhì)粒后均表現(xiàn)出綠色熒光,人腎臟上皮細胞無顯色。熒光定量PCR檢測也表明兩種重組質(zhì)粒只有在轉(zhuǎn)染至奶牛原代乳腺上皮細胞后,基因Lyz、TAP相對表達量極顯著高于未轉(zhuǎn)染空白對照組,在人腎臟上皮細胞中無表達。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的原代乳腺上皮細胞感染金黃色葡萄球菌后,細胞存活率顯著高于未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的對照組,與未感染金黃色葡萄球菌、未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的空白組對比沒有顯著差異。細胞死亡率極顯著低于對照組(P0.01)。3重組質(zhì)粒小鼠乳腺的表達和安全性評價通過尾靜脈注射法使用基因體外轉(zhuǎn)染試劑,將重組質(zhì)粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP轉(zhuǎn)染至處于泌乳高峰期的小鼠體內(nèi),熒光定量PCR結(jié)果顯示,小鼠乳腺組織中基因TAP和Lyz的表達水平顯著增加。在小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟中未檢測到靶基因的表達。Western Blot檢測顯示,在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的小鼠乳腺組織中檢測到重組質(zhì)粒綠色熒光蛋白基因EGFP所表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物,在未用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的小鼠乳腺組織中未檢測到該表達產(chǎn)物。對小鼠的各種生理生化指標進行檢測表明,發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒對小鼠行為活動指標、質(zhì)量變化、血液生化指標、臟器指數(shù)無顯著影響。本研究制備了兩種新型乳腺特異性表達質(zhì)粒,并驗證了細胞水平、活體水平的表達情況和抗菌效果,為未來該質(zhì)粒應(yīng)用于奶牛乳腺炎的防治奠定了一定的基礎(chǔ),為奶牛乳腺炎的防治提供了新思路、新方法,為奶牛溶菌酶、奶牛氣管抗菌肽在奶牛乳腺中特異性表達、研發(fā)新型可替代抗生素產(chǎn)品提供重要理論依據(jù)和技術(shù)支持。
【圖文】：

鵬奶牛溶菌酶基因（Ｌｙｚ）和氣管抗菌肽基因（ＴＡＰ）表徸質(zhì)粒的構(gòu)建、抗菌效果及安全具有抗菌、消炎、組織修復及提高免疫力等多方面的功能？。根據(jù)溶菌酶的生用機理，溶菌酶可分為四類：噻菌體Ｔ４溶菌酶（ｐｈａｇｅ－ｔｙｐｅ）、植物源溶菌酶（ｅ）邋、邋微生物溶菌酶邋（邋ｂａｃｔｅｒｉａ－ｔｙｐｅ）邋和動物源溶菌酶。邋動物來源的溶菌酶是最豐富的溶菌酶，包括溶菌酶邋ｃ邋型（ｃｈｉｃｋｅｎｔｙｐｅ）、ｇ邋型（ｇｏｏｓｅ－ｔｙｐｅ）和邋ｉ邋型（ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ－ｔｙＥｎｚｙｍｅ邋ｄｉｓｔｏｒｔｓ邋ｔｈｅ邋ｓｕｇａｒ邋ｉｎ邋ｓｉｔｅ邋Ｄ逡逑ｍａｋｉｎＩｔ邋ｕｎｓｔａｂｌｅａｏｗｎ

酶在皺胃中消化分解細菌，消化成分被小腸吸收。該機制可有效的運行源于消化型溶菌酶逡逑能抗胃蛋白酶（ｐｅｐｓｉｎ）的消化拆解，使其在酸性ｐＨ環(huán)境中具有最佳活性。牛胃溶菌酶（ＢＳＬ２）逡逑在酸性環(huán)境中具有高構(gòu)象穩(wěn)定性，牛胃溶菌酶晶體結(jié)構(gòu)如圖２所示，牛胃溶菌酶分子由ａ逡逑結(jié)構(gòu)域和Ｐ結(jié)構(gòu)域組成。四個ａ螺旋（Ａ－Ｄ）組成一個ａ結(jié)構(gòu)域。大環(huán)和三個ｐ折疊形成的逡逑反平行Ｐ股最終組成了邋Ｐ結(jié)構(gòu)域。由ＢＳＬ２晶體結(jié)構(gòu)可知，帶負電荷的表面、縮短的大環(huán)逡逑和鹽橋可以保證結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此抵抗胃蛋白酶［４°］。逡逑Ｇ－ｈｅｌｉｘ逡逑ｆｉ，，邋＾邐＜邐，逡逑ｌ．邋／邋ｐ－ｔｅｉｔｎｉｎｕｓ逡逑Ｄ－ｈｅｌｉｘ邐，逡逑Ｓ＼邋Ａ－ｈｅｌｂ逡逑ａ—ｄｏｍａｉｎ邐＼邐｜逡逑．逡逑Ｃ—ｌｅｒｍｉｉｕｉｓ逡逑圖２牛胃溶菌酶ＢＳＬ２晶體結(jié)構(gòu)［４°］逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｂｏｖｉｎｅ邋ｓｔｏｍａｃｈｌｙｓｏｚｙｍｅ邋２邋（ＢＳＬ２）逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;S858.23

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