發(fā)布時間：2020-05-30 20:19

【摘要】：本課題研究以狂犬病病毒疫苗毒LBNSE株的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)為骨架,分別用RT-PCR擴(kuò)增CVS-11株(標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株)與SAD株(疫苗毒株)的G基因,將該基因分別與pLBNSE質(zhì)粒中的的G基因進(jìn)行替換,構(gòu)建兩株重組質(zhì)粒。利用反向遺傳學(xué)系統(tǒng)拯救出兩株重組不同毒力狂犬病G蛋白的重組病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG,然后對兩株病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行探究。應(yīng)用Overlap PCR的方法,利用Snapgene生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)引物,對實(shí)驗(yàn)室保存的全長pLBNSE質(zhì)粒的Pst I和EcoR I酶切位點(diǎn)進(jìn)行改造,改造后質(zhì)粒命名為r-pLBNSE。根據(jù)GenBank上發(fā)表的SAD株和CVS11株的全基因序列,利用Primer5生物學(xué)軟件分別設(shè)計(jì)G基因引物(G基因前加信號肽和flag標(biāo)簽),分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增出SAD株和CVS11株的G基因序列。將擴(kuò)增出的G基因序列,經(jīng)酶切、連接等步驟替換到改造后的r-pLBNSE質(zhì)粒上,構(gòu)建出重組G基因的全長質(zhì)粒并命名為r-pLBNSE-SfG(帶 flag 標(biāo)簽的 SAD 株 G 基因)和 r-pLBNSE-CfG(帶 flag 標(biāo)簽的 CVS11株G基因)。利用反向遺傳學(xué)系統(tǒng),將重組全長質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒pH-N、pH-P、pH-G和pH-L共轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞,拯救出重組病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG。應(yīng)用直接免疫熒光和RT-PCR的方法鑒定拯救的重組病毒。通過探究兩株重組病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG的生物學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)重組病毒的生長特性與親本毒株相一致,通過對糖蛋白表達(dá)量的比較發(fā)現(xiàn)重組病毒糖蛋白表達(dá)量明顯低于親本毒株,而致病性由強(qiáng)到弱依次為rLBNSE-CfG≥rLBNSE-SfG≥LBNSE。本實(shí)驗(yàn)為探究狂犬病的致病機(jī)理、病毒的包裝、運(yùn)輸、釋放及病毒的神經(jīng)嗜性與糖蛋白的關(guān)系等機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖２狂犬病病毒結(jié)構(gòu)模型逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ｒａｂｉｅｓ邋ｖｉｍｓ逡逑

圖３全長克隆質(zhì)粒的改造策略逡逑Ｆｉｇ．３邋Ｔｈｅ邋ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｎｅｗ邋ｆｌｉｌｌ邋ｃｌｏｎｅ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ逡逑
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.655

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2688667