【摘要】：單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)為革蘭氏陽性菌胞內(nèi)寄生菌,廣泛存在于生鮮食品和環(huán)境中。單增李斯特菌可穿過腸屏障,通過血流傳播并到達(dá)肝臟,脾臟,中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎兒,最終引起人敗血癥、腦炎、腦膜炎和胃腸炎及孕婦流產(chǎn),死亡率可達(dá)30%,是最嚴(yán)重的人類食源性感染之一。單增李斯特菌在感染過程中,需要表達(dá)多種毒力蛋白來完成對宿主細(xì)胞的感染。單增李斯特菌將毒力因子分泌到胞外,需要不同的分泌系統(tǒng)參與,目前已知主要是Sec分泌系統(tǒng)和Tat分泌系統(tǒng)承擔(dān)分泌功能,而鞭毛分泌系統(tǒng)是否也參與了特殊因子的分泌目前還未有報(bào)道。因此,本研究主要闡明了:1.單增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711的體外酶學(xué)功能及其在細(xì)菌感染過程中的生物學(xué)作用。2.單增李斯特菌鞭毛結(jié)構(gòu)元件FlhB的生物學(xué)功能。1.單增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711的酶學(xué)特征與參與細(xì)菌感染我們通過生物信息學(xué)分析預(yù)測Lmo1711屬于氨基肽酶M29家族,氨基肽酶II型,可以水解氨基酸N端殘基對蛋白進(jìn)行修飾。酶活分析顯示,Lmo1711具有較強(qiáng)的氨基肽酶活性,針對不同底物的結(jié)合和催化能力差異較大。在單肽對硝基苯胺底物中,Lmo1711與亮氨酸對硝基苯胺(Leu-pNA)、精氨酸對硝基苯胺(Arg-pNA)和賴氨酸對硝基苯胺(Lys-pNA)反應(yīng)對應(yīng)的K_(cat)/K_m分別為3.149×10~5min~(-1)M~(-1)、1.536×10~5min~(-1)M~(-1)和1.035×10~4min~(-1)M~(-1),由此可見Lmo1711對Leu-pNA的催化效率最高,即對亮氨酸殘基的親和程度最高;對多肽對硝基苯胺切割能力較弱。Lmo1711氨基肽酶活性具有金屬離子依賴性,Co~(2+)、Cd~(2+)、Zn~(2+)等多種金屬離子均能顯著增強(qiáng)其活性,其中Co~(2+)的激活效應(yīng)最顯著。酶學(xué)分析表明,Lmo1711保守的關(guān)鍵氨基酸活性位點(diǎn)(Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380)決定了Lmo1711的催化活性。生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn),缺失lmo1711后細(xì)菌生長能力不受影響,但缺失株感染Caco-2細(xì)胞后其侵襲和增殖能力顯著低于野生株。此外,缺失該基因后細(xì)菌在L929細(xì)胞中的遷移能力亦顯著降低。本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí),單增李斯特菌Lmo1711屬于M29氨基肽酶家族成員,具有較強(qiáng)的催化活性,且對金屬離子具有不同程度的依賴性,并且在一定程度上參與了細(xì)菌在細(xì)胞中的感染。2.單增李斯特菌鞭毛結(jié)構(gòu)元件FlhB生物學(xué)功能研究本研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白FlhB(由lmo0679基因編碼)參與了細(xì)菌的鞭毛合成與運(yùn)動(dòng)。缺失flhB后李斯特菌不形成鞭毛,運(yùn)動(dòng)能力完全喪失,并導(dǎo)致motA、flaA、fliN、fliI、fliK、flgC等多種鞭毛相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和FliM、Fli Y和Fla A等鞭毛蛋白的表達(dá)水平降低。基于細(xì)菌鞭毛與III型分泌系統(tǒng)的親緣性,本研究以單增李斯特菌鞭毛結(jié)構(gòu)元件FlhB為主要研究對象,進(jìn)一步探索了李斯特菌鞭毛結(jié)構(gòu)與蛋白分泌功能之間的關(guān)聯(lián)。我們利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ)方法分別對flhB和fliS的基因缺失株中分泌蛋白進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)譜分析。iTRAQ結(jié)果顯示,李斯特菌缺失flhB和fliS后大量的鞭毛與非鞭毛相關(guān)蛋白分泌量下降。具體來看,在37℃條件下,缺失flhB后有38種蛋白分泌量上調(diào),39種蛋白分泌量下調(diào);缺失fliS后有25種蛋白分泌量上調(diào),25種蛋白分泌量下調(diào)。在30℃條件下,缺失flhB后有29種蛋白分泌量上調(diào),62種蛋白分泌量下調(diào);缺失fliS后有23種蛋白分泌量上調(diào),57種蛋白分泌量下調(diào)。可以看出,在30℃條件下,flhB和fliS缺失后下調(diào)的蛋白數(shù)量明顯多于在37℃。COG(Cluster of orthologous group)功能分類顯示,這些差異蛋白主要參與翻譯,核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生以及糖轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝等過程;GO(Gene ontology)分析鑒定發(fā)現(xiàn),差異蛋白主要是細(xì)胞組分(27.74%),巨分子復(fù)合物(12.19%)和細(xì)胞器(12.01%)。經(jīng)過查詢Uniprot等蛋白信息網(wǎng)站與相關(guān)文獻(xiàn),我們從中選取了鞭毛鉤調(diào)節(jié)蛋白FliK、鞭毛絲組件蛋白FlaA和細(xì)胞分裂調(diào)控蛋白DivIVA等李斯特菌中報(bào)道較少的蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。WB結(jié)果顯示,在30℃條件下,flhB缺失后,DivIVA,FliK和FlaA分泌量顯著下降;fliS缺失后Fli K和FlaA分泌量顯著下降。其中DivIVA與細(xì)菌的分裂增殖相關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)單增李斯特菌FlhB參與了細(xì)菌運(yùn)動(dòng),鞭毛合成,鞭毛與非鞭毛蛋白分泌等過程,為進(jìn)一步探索單增李斯特的非經(jīng)典分泌機(jī)制與致病機(jī)制提供了初步試驗(yàn)基礎(chǔ)。綜上,本研究:(1)首次探索并證實(shí)了單增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711屬于金屬離子依賴的M29氨基肽酶家族成員,并參與了細(xì)菌在細(xì)胞中的感染和遷移,與細(xì)菌毒力相關(guān)。研究結(jié)果對于深入完善和挖掘李斯特菌新的毒力因子及致病機(jī)制具有重要意義。(2)首次探索了單增李斯特菌鞭毛結(jié)構(gòu)元件FlhB的生物學(xué)功能和介導(dǎo)的分泌作用,為后續(xù)進(jìn)一步研究革蘭氏陽性菌鞭毛T3SS及新的分泌型蛋白的生物學(xué)功能奠定了關(guān)鍵基礎(chǔ)。
【圖文】：

2 單增李斯特菌感染機(jī)制單增李斯特菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，能夠感染人和動(dòng)物消化道黏膜細(xì)胞并定植，進(jìn)而侵染宿主細(xì)胞。首先是黏附與侵襲細(xì)胞的過程；單增李斯特菌游動(dòng)到達(dá)細(xì)胞表面后，表達(dá)黏附和侵襲相關(guān)因子[8]，主要是內(nèi)化素 A（InlA）[9]和內(nèi)化素 B（InlB）分別與宿主細(xì)胞表面受體蛋 E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和肝細(xì)胞生長因子（Met）結(jié)合[10]，進(jìn)而通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。其次是逃離吞噬體的過程，菌體進(jìn)入細(xì)胞之后被脂質(zhì)膜包裹形成吞噬體，細(xì)菌此時(shí)表達(dá)溶血素 LLO[11]和磷脂酶 PlcA、PlcB，隨后在 LLO、PlcA 和 PlcB 等共同作用下吞噬體被溶解[12, 13]，，圖 1.2016 年 8 月至 2017 年 3 月，美國發(fā)生了 8 例李斯特菌病，其中 2 人死亡Figure 1. From August 2016 to March 2017, 8 cases of listeriosis occurred in the UnitedStates, including 2 deaths

氨基肽酶概述氨基肽酶作為一種水解酶，可能參與單增李斯特菌毒力因子修飾，進(jìn)而與感染過程存在某種關(guān)聯(lián)。氨基肽酶是針對寡肽、多肽和蛋白質(zhì)水解 N 末端殘基的酶[16]，不僅能夠完全降解蛋白質(zhì)和多肽，使得組分氨基酸被重新利且用于蛋白質(zhì)翻譯后加工，使得蛋白質(zhì)在到達(dá)正確的空間位置或處于必需的發(fā)育環(huán)境前無法被激活[17]。絕大部分氨基肽酶都具有金屬離子依賴性，其基列存在 H-E-X-X-H（His-Glu-X-X-His）活性位點(diǎn)序列對于催化和配位金屬是必需的。金屬蛋白酶活性由一個(gè)或兩個(gè)二價(jià)離子（通常是鋅）介導(dǎo)，這些激活水分子以進(jìn)行底物肽鍵的親核攻擊，進(jìn)而起到降解、加工、抑制等作用[屬蛋白酶對機(jī)體也具有多樣性的功能，例如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是參圖 2. 單增李斯特菌胞內(nèi)生命周期[1]Figure 2 Intracellular life cycle of Listeria. monocytogenes[1]
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61

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本文編號：2687200