【摘要】：本論文旨在研究載銅鋅蒙脫石(Cu/Zn-Mt)對(duì)斷奶仔豬腸道微生態(tài)和屏障功能的影響并探究其防治斷奶仔豬應(yīng)激性腹瀉的可能作用機(jī)理。以蒙脫石為載體,負(fù)載銅鋅制備了載銅鋅蒙脫石(Cu/Zn-Mt),通過體外實(shí)驗(yàn)研究了 Cu/Zn-Mt對(duì)細(xì)菌活性、腸上皮屏障功能和炎癥反應(yīng)的影響;仔豬飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究了 Cu/Zn-Mt對(duì)斷奶仔豬生長性能、腹瀉、腸道微生態(tài)和屏障功能的影響,并使用16SrRNA高通量測序、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)闡明其作用機(jī)制,為有效解決斷奶仔豬腹瀉問題提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1 Cu/Zn-Mt制備、表征、抗菌活性及細(xì)胞毒性研究本試驗(yàn)以蒙脫石為載體,負(fù)載抗菌金屬離子(Cu2+/Zn2+)制備了一系列的改性蒙脫石:載銅蒙脫石(Cu-Mt),載鋅蒙脫石(Zn-Mt),不同銅鋅比例的載銅鋅蒙脫石(Cu/Zn-Mtl、Cu/Zn-Mt2、Cu/Zn-Mt3)。通過X射線衍射、傅里葉變換紅外光譜、透射電鏡等方法對(duì)制得的改性蒙脫石進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,并測定了其表面積、抗菌活性及細(xì)胞毒性。結(jié)果表明:銅和鋅主要是以水合陽離子的形式,以離子交換的方式進(jìn)入蒙脫石晶格層間,還有少量的銅和鋅以化學(xué)吸附的形式進(jìn)入Si-O四面體和Al-O八面體的微孔中;改性蒙脫石仍為層狀結(jié)構(gòu),為多層蒙脫石晶片組成。抗菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與Cu-Mt,Zn-Mt相比,Cu/Zn-Mt提高了抗細(xì)菌活性,表現(xiàn)出協(xié)同抗菌效果,抗菌機(jī)理可能是由于銅鋅之間的相互協(xié)同作用。3種不同銅鋅負(fù)載比例的Cu/Zn-Mt中,Cu/Zn-Mt-1與Cu/Zn-Mt-2抗細(xì)菌活性效果最好。另外,以Cu/Zn-Mt-2為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)其抗細(xì)菌活性與其粒徑大小有關(guān)。粒徑越小,比表面積越大,Cu/Zn-Mt-2抗菌活性效果越好。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明Cu/Zn-Mt-2對(duì)IPEC-J2細(xì)胞表現(xiàn)出較弱的毒性。本試驗(yàn)進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、透射電鏡、掃描電鏡、DNA電泳等方法研究Cu/Zn-Mt處理對(duì)E.Coli活性的影響,以此來探明Cu/Zn-Mt抗菌機(jī)理。結(jié)果表明:1)Cu/Zn-Mt可通過銅鋅離子和吸附E.Coli起到抗菌作用;2)Cu/Zn-Mt處理使細(xì)菌活性氧增加、細(xì)胞膜通透性增加、DNA降解、抑制生物膜形成;3)Cu/Zn-Mt處理可獲得153個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因133個(gè),下調(diào)基因20個(gè);GO功能注釋顯示差異基因主要與金屬離子結(jié)合和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),蛋白、酶、核酸等生物合成和代謝過程等相關(guān);KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)共有41個(gè)基因注釋到7個(gè)代謝通路中,其中硫代謝、核酸降解、嘌呤代謝、核糖核酸聚合酶、氨基酸代謝合成等代謝通路顯著富集;結(jié)果提示,以蒙脫石為載體,負(fù)載銅鋅制備的Cu/Zn-Mt具有協(xié)同抗菌活性以及較弱的細(xì)胞毒性,通過干擾細(xì)菌酶、蛋白、核酸等生物合成和代謝過程,使細(xì)菌失去正常的功能,從而發(fā)揮較長的抗菌性能。2 Cu/Zn-Mt對(duì)E.Coli誘導(dǎo)的體外腸上皮屏障損傷的影響本試驗(yàn)利用豬腸上皮IPEC-J2細(xì)胞構(gòu)建E.Coli誘導(dǎo)的體外腸上皮屏障損傷模型來研究Cu/Zn-Mt對(duì)E.Coli誘導(dǎo)的體外腸上皮屏障功能的影響。本實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)部分:1:研究Cu/Zn-Mt預(yù)處理對(duì)E.Coli誘導(dǎo)的體外腸上皮屏障損傷的影響。2:Cu/Zn-Mt對(duì)E.Coli感染后體外腸上皮屏障的影響。實(shí)驗(yàn)一結(jié)果表明:1)與對(duì)照組相比,E.Coli感染IPEC-J2細(xì)胞顯著增加了(P0.05)transwell細(xì)胞上室、下室培養(yǎng)基中E.Coli數(shù)量,降低了(P0.05)腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻TER,增加了(P0.05)FD4通透性,引起緊密連接蛋白(Occludin、ZO-1、Claudin-1和Claudin-2)分布紊亂;Cu/Zn-Mt預(yù)處理顯著降低了(P0.05)transwell細(xì)胞上室、下室培養(yǎng)基中E.Coli數(shù)量,緩解了E.Coli誘導(dǎo)的腸上皮屏障TER的下降和FD4通透性的升高(P0.05),顯著抑制了緊密連接蛋白分布紊亂(P0.05)。實(shí)驗(yàn)二結(jié)果表明:E.Coli感染IPEC-J2細(xì)胞引起腸上皮屏障損傷,緊密連接蛋白分布紊亂,促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加;在此基礎(chǔ)上外源添加Cu/Zn-Mt可緩解E.Coli誘導(dǎo)的腸上皮屏障TER的下降和FD4通透性的升高(P0.05),顯著抑制了緊密連接蛋白分布紊亂(P0.05)。另外,外源添加Cu/Zn-Mt還可降低(P0.05)促炎細(xì)胞因子(CXCL1、CXCL2、CXCL6、IL-6、IL-8、TNF-α)的表達(dá)。綜上所述,Cu/Zn-Mt保護(hù)體外腸上皮細(xì)胞屏障的途徑有兩種:1,通過抑制E.Coli增殖從而減少E.Coli感染腸上皮細(xì)胞引起的損傷。2,Cu/Zn-Mt直接作用于腸上皮細(xì)胞,修復(fù)腸上皮細(xì)胞屏障的損傷。3 Cu/Zn-Mt對(duì)斷奶仔豬生長性能,腸道菌群和腸屏障功能的影響本試驗(yàn)旨在研究日糧中添加Cu/Zn-Mt對(duì)斷奶仔豬生長性能,腸道菌群和腸屏障功能的影響。選取72頭21±1日齡,體重約為6.36kg的“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬,隨機(jī)分為2處理組,每個(gè)處理6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6頭豬,飼養(yǎng)試驗(yàn)周期為14天。按日糧添加水平設(shè):基礎(chǔ)飼糧組(對(duì)照組)和基礎(chǔ)日糧+2 g/kg Cu/Zn-Mt(Cu/Zn-Mt組)。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,Cu/Zn-Mt組顯著增加了(P0.05)斷奶仔豬平均日增重、飼料效率、空腸絨毛高度和隱窩深度比值、空腸微絨毛高度、腸黏膜緊密連接蛋白(Occludin,Claudin-1和ZO-1)、血清和回腸粘膜銅鋅含量;Cu/Zn-Mt組空腸絨毛生長較茂密、排列規(guī)則、整齊均勻;Cu/Zn-Mt顯著降低了(P0.05)腹瀉指數(shù),空腸熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖的通透性,空腸、結(jié)腸大腸桿菌和鏈球菌的數(shù)量。Cu/Zn-Mt組對(duì)糞便銅鋅含量、菌群耐藥基因、耐銅/鋅基因表達(dá)無影響(P0.05);結(jié)果提示,日糧中添加Cu/Zn-Mt可以提高斷奶仔豬的生長性能,增加斷奶仔豬血清、回腸粘膜銅鋅含量,降低腹瀉率,抑制腸道中有害菌的增殖,改善腸道黏膜屏障,且不會(huì)誘導(dǎo)耐藥細(xì)菌和抗銅鋅細(xì)菌增加。4基于16sRNA測序技術(shù)和代謝組學(xué)技術(shù)研究Cu/Zn-Mt對(duì)斷奶仔豬腸道微生態(tài)的影響本試驗(yàn)以16sRNA測序和代謝組學(xué)為技術(shù)手段,研究日糧中添加Cu/Zn-Mt對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝的影響。結(jié)果顯示:16sRNA測序顯示,與對(duì)照組相比,日糧中添加Cu/Zn-Mt顯著改變了腸道菌群結(jié)構(gòu),降低了結(jié)腸菌群中potential pathogenic菌的比例,增加了 stress tolerence菌的比例。在門水平上,Cu/Zn-Mt組顯著增加了Firmicutes相對(duì)豐度,降低了(P0.05)Bacteroidetes、Proteobacteria相對(duì)豐度。在屬水平上,與對(duì)照組相比,Cu/ZnMt組顯著增加了(P0.05)Coprococcus、Lactobacillus、Eubacterium、Akkermansia、f_Lachnospiraceae、Bifidobacterium、Roseburia、Faecalibacterium、Enterococcus相對(duì)豐度,降低了(P0.05)Clostridium、f_Erysipelotrichaceae、Turicibacter、Streptococcus、Prevotella、f_Enterobacteriaceae相對(duì)豐度。KEGG代謝通路分析結(jié)果顯示Cu/Zn-Mt處理顯著增加了(P.05)腸道菌群代謝功能在金屬離子吸收代謝、氨基酸代謝、抗感染能力等代謝途徑富集,減少了(P0.05)相關(guān)炎癥信號(hào)通路、脂多糖生物合成、凋亡、細(xì)菌入侵腸上皮等代謝通路富集。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)顯示,與對(duì)照組相比,Cu/Zn-Mt組發(fā)生顯著性變化的結(jié)腸差異代謝產(chǎn)物有19種(P0.05),差異代謝產(chǎn)物主要涉及丁酸鹽代謝、氨基酸代謝(谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、組氨酸等)、脂肪代謝(膽汁酸合成、肉堿合成、脂肪酸代謝、花生四烯酸代謝、亞麻酸和亞油酸代謝、短鏈飽和脂肪酸的線粒體-氧化作用)、嘌呤代謝、尿素循環(huán)、糖代謝(丙酮酸代謝)、維生素代謝(煙酸和煙酰胺代謝)、類固醇生成。結(jié)果提示,日糧中添加Cu/Zn-Mt可改善腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝功能。5 Cu/Zn-Mt對(duì)LPS誘導(dǎo)的斷奶仔豬腸道屏障損傷模型的影響本試驗(yàn)利用LPS誘導(dǎo)斷奶仔豬腸道屏障損傷模型,旨在研究Cu/Zn-Mt對(duì)腸上皮屏障損傷的影響,探索Cu/Zn-Mt保護(hù)屏障的分子信號(hào)機(jī)制。試驗(yàn)選取18只21±1日齡斷奶仔豬隨機(jī)分為三組,每組6只。對(duì)照組和LPS組飼喂基礎(chǔ)日糧,LPS+Cu/Zn-Mt組飼喂基礎(chǔ)日糧+2g/kg Cu/Zn-Mt。飼喂14天后,LPS組和LPS+Cu/Zn-Mt組腹腔注射大腸桿菌LPS,注射劑量為100 μg/kg體重,對(duì)照組腹腔注射相同量的0.9%氯化鈉溶液。注射4h后取樣分析。結(jié)果表明,與對(duì)照相比,LPS組處理顯著降低了腸道TER、緊密連接蛋白,增加了 FD4通透性,促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá),表明LPS誘導(dǎo)仔豬腸屏障損傷。與LPS組相比,日糧中添加Cu/Zn-Mt顯著增加了(P0.05)空腸TER,緊密連接蛋白的表達(dá),降低了 FD4通透性,促炎細(xì)胞因子(TNF-α IL-1β、IL-6、IFN-γ和 IL-8)的mRNA表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示,與LPS組相比,日糧中添加Cu/Zn-Mt可上調(diào)(P0.05)細(xì)胞核和細(xì)胞外泌體中的差異表達(dá)基因,影響炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等相關(guān)生物過程,減輕腸道炎癥反應(yīng),具體作用機(jī)制可能與影響Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子活性、NF-kB信號(hào)通路等代謝通路有關(guān)。結(jié)果提示:日糧中添加Cu/Zn-Mt可通過減輕腸道炎癥,從而緩解LPS誘導(dǎo)的腸道屏障損傷。綜上所述,本試驗(yàn)以蒙脫石為載體制備的Cu/Zn-Mt具有較強(qiáng)的抗菌能力,同時(shí)具有修復(fù)受損的上皮屏障功能,緩解E.Coli引起的炎癥反應(yīng)。日糧添加Cu/Zn-Mt可改善斷奶仔豬生長性能,降低斷奶仔豬腹瀉,緩解斷奶應(yīng)激。其緩解斷奶應(yīng)激的作用機(jī)制可能與改善腸道微生態(tài),緩解腸道炎癥,從而保護(hù)斷奶仔豬腸上皮屏障功能有關(guān)。
【圖文】：

石是膨潤土的主要成分，其在中國礦產(chǎn)資源豐富，有４００多處礦點(diǎn)分布于２３個(gè)逡逑省區(qū)（遼寧、黑龍江、吉林、河北、河南、浙江等），已探明儲(chǔ)量位居世界第一。逡逑如圖１．１所示，蒙脫石是一種層狀結(jié)構(gòu)、片狀結(jié)晶的顆粒極細(xì)的含水硅鋁酸逡逑鹽，基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)單元由兩層硅氧（Ｓｉ－Ｏ）四面體，中間夾著鋁氧（Ａ１－０）八面體交替逡逑排列的２：１層狀結(jié)構(gòu)，，屬于典型的２：１型“三明治”結(jié)構(gòu)，層厚約為ｌｎｍ，長寬逡逑約為ｌＯＯｎｍ６６。單元層之間的空間被稱為“層間域”或“層間”。理論上，蒙脫逡逑石的組成成分為Ｓｉ０２邋（６６．７％）邋，邋Ａｌ２0３邋（２８．３％）邋，邋Ｈ２０邋（５％）邋６７。但由于礦物逡逑共生組合不同，實(shí)際上蒙脫石層間還含有少量的ＭｇＯ、ＣａＯ、Ｎａ２０、Ｆｅ２０３等組逡逑分。蒙脫土具有帶電荷性、親水性、膨脹性、分散懸浮性、吸附性、較大的比表逡逑面積、陽離子交換能力、粘附能力等重要物理化學(xué)特性。逡逑比表面積大蒙脫石顆粒細(xì)�。叫∮冢插澹穑恚�，通常以數(shù)以千計(jì)的結(jié)果單元逡逑層堆砌而成，比表面積大，同時(shí)具有巨大的表面能６８。以粒徑２邋ｐｍ算，每個(gè)鈉逡逑基蒙脫石顆粒可由１３００多個(gè)蒙脫石結(jié)構(gòu)單元層高度的片體組成。逡逑帶負(fù)電荷６９蒙脫石Ｓｉ－０四面體片中的少量Ｓｉ４＋會(huì)被Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋等低價(jià)離子逡逑取代

３．１．１改性Ｍｔ結(jié)構(gòu)表征分析逡逑ＸＲＤ射線結(jié)果表明了邋Ｃｕ／Ｚｎ離子可插層進(jìn)入Ｍｔ層間。改性Ｍｔ的層間間距逡逑ｄ（＿如圖２．１所示。Ｎａ－Ｍｔ衍射峰的（１＿）值為１．５３４ｎｍ。改性蒙脫石中，Ｃｕ－Ｍｔ、逡逑Ｚｎ－Ｍｔ、Ｃｕ／Ｚｎ＿Ｍｔ－ｌ、Ｃｕ／Ｚｎ－Ｍｔ－２邋和邋Ｃｕ／Ｚｎ－Ｍｔ－３邋的邋ｃＷｈ）分別為邋１．６５４ｎｍ、１．６３８逡逑ｎｍ、１．６４９邋ｎｍ、１．６４１邋ｎｍ、１．６４５邋ｎｍ。雖然邋Ｃｕ／Ｚｎ邋離子半徑分別為邋０．０７２邋ｒａｎ、０．０７４逡逑ｎｍ，小于鈉離子半徑０．０９５邋ｎｍ，但改性Ｍｔ的層間距明顯大于Ｎａ－Ｍｔ的層間距。逡逑Ｃｕ／Ｚｎ離子可能以水和陽離子的形式插層進(jìn)入Ｍｔ。已有研究報(bào)道Ｃｕ／Ｚｎ離子分逡逑別以［Ｚｎ（Ｈ２０）６］２＋邋／邋［Ｃｕ（Ｈ２０）６］２＋的形式與Ｍｔ層間鈉離子進(jìn)行交換。另外，各種改逡逑性Ｍｔ層間距ｃＷｍ差異不大，可能與Ｃｕ離子和Ｚｎ離子的半徑大小相差不大有逡逑關(guān)。逡逑Ｉ邋．１．６４３ｎｍ逡逑＼Ｊ＼邐ｉ邐Ｃｕ／Ｚｎ－Ｍｔ－３逡逑一邐人邐一逡逑．ｍ邋１．６４０ｎｍ逡逑？，壚逡逑＼Ｊ＼＾＾邐Ｃ＾Ｚｎ－ＭＭ逡逑１邋Ａｌ．６３４ｎｍ逡逑‘邐復(fù)邋Ｚｎ－Ｍｔ逡逑Ｉ邋ｉｌ邋１．６５４ｎｍ逡逑＾＾－久邐Ｃｕ￣Ｍｔ逡逑＼邋ｌ＼邋１．５３４ｎｍ逡逑ＶＶ．邐，邐＞邋Ｎａ－Ｍｔ逡逑Ｉ邐１邐Ｉ邐＇邐Ｉ邐？邐Ｉ邐１邐Ｉ逡逑０邐２０邐４０邐６０邐８０逡逑２０（°）逡逑圖２．１改性Ｍｔ的ＸＲＤ衍射圖逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋ＸＲＤ邋ｐａｔｔｅｒｎｓ邋ｏｆ邋ｍｏｄｉｆｉｅｄ邋Ｍｔ逡逑３２逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S828.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2686903