【摘要】：棘球蚴病(echinococcosis)是由棘球?qū)俳{蟲(chóng)(Echinococcus spp.)的幼蟲(chóng)——棘球蚴寄生于牛、羊及人的肝、肺等組織器官而引起的一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)病。多房棘球絳蟲(chóng)的中絳期幼蟲(chóng)——多房棘球蚴可寄生于嚙齒動(dòng)物和人,引起泡球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)。microRNAs(miRNAs)是一類具有調(diào)節(jié)功能的小RNA分子,大量數(shù)據(jù)表明它們?cè)诩纳x(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育及其抗感染免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此,開(kāi)展小鼠miRNA分子在多房棘球蚴感染過(guò)程中的相關(guān)研究,不僅能夠揭示其致病機(jī)理,而且對(duì)尋找新的藥物靶標(biāo)具有重要意義。鑒于此,主要開(kāi)展了以下幾個(gè)方面的研究:建立多房棘球蚴的BALB/c小鼠感染模型。間接ELISA和不同感染時(shí)期的剖檢結(jié)果均顯示,小鼠感染率保持在38%左右。以此為基礎(chǔ),從細(xì)胞凋亡入手,利用流式細(xì)胞術(shù)首先檢測(cè)感染多房棘球蚴三個(gè)月小鼠脾臟細(xì)胞的凋亡水平,結(jié)果表明,與對(duì)照組小鼠(腹腔注射PBS)相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠(腹腔注射原頭蚴)脾臟細(xì)胞的凋亡水平顯著下降(P0.05)。為探究脾臟細(xì)胞凋亡發(fā)生改變可能的分子機(jī)制,利用高通量RNA-seq測(cè)序技術(shù),分析脾臟細(xì)胞中的miRNAs表達(dá)譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種miRNA分子呈差異表達(dá),miR-124-3p、miR-9-5p、miR-129-2-3p、miR-1a-3p、miR-128-3p(表達(dá)上調(diào))、miR-16-5p和miR-146a-5p(表達(dá)下調(diào))。生物信息學(xué)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),miR-146a-5p的靶標(biāo)分子中有13種分子與免疫或細(xì)胞凋亡相關(guān),如TLR3、IRAK1、NFAM1、IRAK2、TRAF6和BAG-1等等,故選擇該miRNA分子進(jìn)行深入研究。分離不同感染時(shí)期小鼠脾臟細(xì)胞,利用qPCR確定不同感染時(shí)期miR-146a-5p表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在感染后第二個(gè)月(P0.01)和第三個(gè)月(P0.05),miR-146a-5p的表達(dá)水平均顯著下調(diào),而在第一個(gè)月時(shí),其表達(dá)水平基本不變,表明在多房棘球蚴感染過(guò)程中,miR-146a-5p表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。為進(jìn)一步探究小鼠miR-146a-5p的免疫調(diào)節(jié)作用,利用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7分別轉(zhuǎn)染miR-146a-5p陰性對(duì)照物、模擬物和抑制物,測(cè)定細(xì)胞因子、TLR4/LPS信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因、iNOS的轉(zhuǎn)錄水平和NO含量。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)和抑制miR-146-5p表達(dá)時(shí),部分細(xì)胞因子和TLR4/LPS信號(hào)通路上的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)相反的趨勢(shì),同樣,iNOS轉(zhuǎn)錄水平和NO含量也呈現(xiàn)相反的變化。以上結(jié)果顯示,小鼠miR-146a-5p可能對(duì)巨噬細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。利用RAW 264.7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-146a-5p陰性對(duì)照物、模擬物和抑制物,qPCR和Western blot初步確定BAG-1(抗凋亡基因)為miR-146a-5p的靶標(biāo)基因。分離不同感染時(shí)期小鼠脾臟細(xì)胞,利用qPCR測(cè)定不同時(shí)期BAG-1基因的變化,結(jié)果顯示,BAG-1在感染的第2個(gè)月和第3個(gè)月顯著上調(diào)(P0.05),這與小鼠miR-146a-5p表達(dá)水平的趨勢(shì)剛好相反,進(jìn)一步提示BAG-1可能是miR-146a-5p的靶標(biāo)基因。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果顯示,小鼠miR-146a-5p能與BAG-1 mRNA的3'-UTR特異性結(jié)合,而與BAG-1 mRNA的突變體不結(jié)合。以上結(jié)果表明,miR-146a-5p能與BAG-1 mRNA的3'-UTR特異性結(jié)合,抑制其表達(dá)。進(jìn)一步分析感染多房棘球蚴一個(gè)月、兩個(gè)月時(shí)的小鼠脾臟細(xì)胞的凋亡水平,結(jié)果表明,BALB/c小鼠感染多房棘球蚴兩個(gè)月時(shí),與對(duì)照組相比,脾臟細(xì)胞凋亡水平顯著下降(P0.01),而在感染蟲(chóng)體一個(gè)月時(shí),細(xì)胞凋亡水平基本沒(méi)有變化。對(duì)正常脾臟細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-146a-5p陰性對(duì)照物、模擬物和抑制物,檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平,結(jié)果表明,與抑制物轉(zhuǎn)染組相比,模擬物轉(zhuǎn)染組的脾臟細(xì)胞凋亡水平顯著升高(P0.05)。以上結(jié)果表明,miR-146a-5p可能參與調(diào)節(jié)小鼠脾臟細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。綜上所述,在多房棘球蚴感染BALB/c小鼠的過(guò)程中,小鼠脾臟細(xì)胞miR-146a-5p的表達(dá)顯著下調(diào),導(dǎo)致其靶標(biāo)基因BAG-1的表達(dá)顯著上調(diào),抑制脾臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生,從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答。
【圖文】：

圖 1.1：間接 ELISA 確定 BALB/c 小鼠的感染率Figure 1.1 Determination of the infectious rate of BALB/c mice using indirect ELISA2.3.2 凋亡結(jié)果分析用毛細(xì)管流式細(xì)胞分析儀對(duì)每份處理好的細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測(cè)，并用 Guava 軟件對(duì)細(xì)胞凋亡水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如圖 1.2 所示，加入凋亡陽(yáng)性誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的脾臟細(xì)胞明顯發(fā)生凋亡，凋亡率接近 90%。感染多房棘球蚴 3 個(gè)月時(shí)，與對(duì)照組小鼠的脾臟細(xì)胞相比，，實(shí)驗(yàn)組脾臟細(xì)胞凋亡水平顯著下降（P < 0.05，圖 1.2）。

科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 多房棘球蚴不同感染時(shí)期miR-146a-5p表達(dá)即當(dāng)實(shí)驗(yàn)組血清 OD450平均值+2×標(biāo)準(zhǔn)方差（Mea+2SD）>1.640 時(shí)可認(rèn)定為陽(yáng)性。46 只 BALB/c 小鼠為陽(yáng)性，感染率為 38.4%（圖 1.1）。這與后續(xù)不同感染時(shí)期的實(shí)一致。感染多房棘球蚴的 BALB/c 小鼠模型的成功建立，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的正常。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S855.99

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本文編號(hào)：2686617