【摘要】：從卵泡發(fā)育到排卵需經(jīng)過十分復(fù)雜的生理過程,此過程受內(nèi)分泌激素、免疫調(diào)節(jié)和代謝信號(hào)等多種復(fù)雜因素共同調(diào)節(jié)。目前其相關(guān)過程的分子機(jī)制研究仍然比較有限。課題組前期對(duì)大白豬和太湖豬的排卵前卵泡組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,鑒定出2675個(gè)差異表達(dá)的基因。其中干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1(Interferon-induced transmembrane protein 1,IFITM1)在兩個(gè)豬種間表達(dá)差異極顯著,差異表達(dá)倍數(shù)為3.174。故本研究以IFITM1基因?yàn)檠芯繉?duì)象,以小鼠卵巢顆粒細(xì)胞為研究模型,利用RNAi和超表達(dá)等方法,通過細(xì)胞原代培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、qRT-PCR、Western blot、ELISA、EDU染色、MTT實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù),研究IFITM1基因在卵泡發(fā)育與排卵中的功能及相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.IFITM1基因在卵泡排卵過程中的作用(1)IFITM1基因影響排卵標(biāo)記基因表達(dá)及分子機(jī)制在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞(mouse granulosa cells,mGCs)中,通過qRT-PCR和Western blot等方法表明干擾IFITM1基因的表達(dá)可以顯著促進(jìn)排卵標(biāo)記基因LHR、AREG、EREG和Cyp19a1的表達(dá);補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)IFITM1基因能顯著抑制排卵標(biāo)記基因LHR和Cyp19a1的表達(dá)。在mGCs中,加入3種調(diào)控卵泡發(fā)育或排卵的重要細(xì)胞信號(hào)通路(ERK1/2、TGF-β和PI3K/AKT)的抑制劑阻斷相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路后檢測(cè)排卵相關(guān)標(biāo)記基因。qRT-PCR結(jié)果顯示,阻斷ERK1/2或TGF-β細(xì)胞信號(hào)通路后抑制表達(dá)IFITM1基因,排卵標(biāo)記基因EREG、LHR的mRNA水平仍有顯著上升;阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路后抑制表達(dá)IFITM1基因,排卵標(biāo)記基因LHR、Cyp19a1和EREG的mRNA水平則未出現(xiàn)明顯改變。同時(shí)Western blot結(jié)果顯示,抑制表達(dá)IFITM1基因后,PI3K/AKT信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白p-AKT(Ser473)的蛋白質(zhì)水平顯著降低。以上結(jié)果表明,IFITM1基因通過PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)通路活性影響排卵標(biāo)記基因的表達(dá)。(2)IFITM1基因影響卵巢顆粒細(xì)胞分泌孕酮在mGCs中,超表達(dá)或抑制表達(dá)IFITM1基因后運(yùn)用qRT-PCR方法檢測(cè)孕酮及其受體合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,超表達(dá)IFITM1基因,孕酮受體基因PGR的mRNA水平顯著升高;抑制表達(dá)IFITM1基因,孕酮受體基因PGR的mRNA水平顯著降低,孕酮合成關(guān)鍵基因3β-HSD,StAR mRNA表達(dá)水平顯著升高。在mGCs中,轉(zhuǎn)染pCMV-HA-IFITM1或siRNA-IFITM1后運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清中的孕酮的濃度,結(jié)果表明:超表達(dá)IFITM1基因,孕酮的濃度未出現(xiàn)明顯變化,抑制表達(dá)IFITM1基因,顯著降低孕酮的濃度。以上結(jié)果表明,IFITM1基因能影響小鼠卵巢顆粒細(xì)胞分泌孕酮,并影響顆粒細(xì)胞孕酮受體的合成。2.IFITM1基因影響卵巢顆粒細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IFITM1基因?qū)β殉差w粒細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,超表達(dá)IFITM1基因后,卵巢顆粒細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例顯著降低,抑制表達(dá)IFITM1基因,卵巢顆粒細(xì)胞周期G0/G1期的細(xì)胞比例顯著降低。qRT-PCR結(jié)果顯示,超表達(dá)IFITM1基因,細(xì)胞周期蛋白CCNA2和CCND1 mRNA的表達(dá)水平顯著升高;抑制表達(dá)IFITM1基因,CCND1的mRNA水平顯著降低。在顆粒細(xì)胞中,運(yùn)用EDU染色實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,IFITM1的表達(dá)受到抑制,顆粒細(xì)胞增殖的比例顯著降低。綜上所述,得出結(jié)論:(1)IFITM1基因影響卵巢顆粒細(xì)胞分泌孕酮,并通過影響PI3K/AKT信號(hào)通路活性影響卵泡排卵;(2)IFITM1基因通過調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控因子CCND1的表達(dá)影響卵巢顆粒細(xì)胞周期;IFITM1基因能調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞增殖。
【圖文】：

課題組前期通過對(duì)大白豬和太湖豬的排卵前卵泡組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序5 個(gè)差異表達(dá)的基因。其中干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白 1（IFITM1）在兩豬極顯著，差異表達(dá)倍數(shù)為 3.174。本研究以 IFITM1 基因?yàn)檠芯繉?duì)象，粒細(xì)胞中探究 IFITM1泡發(fā)育和排卵過程及其調(diào)控卵過程是指卵巢中成熟卵泡的破裂和可受精卵母細(xì)胞的釋放。進(jìn)一步細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂、卵泡破裂、卵巢顆粒細(xì)胞重構(gòu)及黃體細(xì)胞的形成等利發(fā)育至排卵前卵泡是排卵發(fā)生的必要條件。卵泡發(fā)育則是指原始卵成熟卵泡并排卵的生理過程（圖 1-1）。卵泡主要由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)成，三種細(xì)胞之間相互作用保證了卵泡的順利發(fā)育。

IFITM1 基因在小鼠卵泡發(fā)育與排卵過程中的功能及相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究制病毒粒子進(jìn)入胞質(zhì)。在細(xì)胞因子方面：IFITM3 是干擾素應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)因子，它能加速自噬體中 IRF3 的轉(zhuǎn)換。IFITM3 也能抑制促炎細(xì)胞因子 IL-6 的產(chǎn)生，，IL-6 可以誘導(dǎo) IFITM 基因的表達(dá)。相比之下，IFITM2 能通過與 BAG3 的細(xì)胞表面受體互作來促進(jìn) IL-6 的上調(diào)表達(dá)。在細(xì)胞遷移和入侵過程中：IFITM3 與 Src，F(xiàn)AK 和 Ambra1等多種蛋白質(zhì)發(fā)生互作，能調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)。IFITM3 協(xié)助粘著點(diǎn)和自噬體之間的 Src 亞細(xì)胞運(yùn)輸。從細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控方面來看，干擾素通過 STAT 信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和生長，其中 IFITM 蛋白作為下游效應(yīng)蛋白。IFITM1 與小窩蛋白-1（CAV-1）互作后能抑制ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)，該信號(hào)是刺激細(xì)胞增殖的關(guān)鍵途徑。同時(shí)，IFITM1 能增強(qiáng)腫瘤抑制因子 p53 的蛋白穩(wěn)定性。綜上所述，IFITM 蛋白能影響對(duì)免疫力有直接和間接影響的各種細(xì)胞過程（圖 1-3）(Lange et al 2003)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S813.1

【參考文獻(xiàn)】

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2 袁森;田明堯;崔鶴馨;靖杰;劉昊;劉存霞;任靜強(qiáng);姜慶利;薛斐;金寧一;;人干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J];中國生物制品學(xué)雜志;2013年05期

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本文編號(hào)：2684880