【摘要】：豬流行性腹瀉病(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由病原體豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染引起的,不同年齡段的豬均可感染,呈現(xiàn)出水樣腹瀉、嘔吐、水腫等臨床癥狀的一種急性腸道傳染病。目前PED已在全世界范圍內(nèi)廣泛流行,造成大量仔豬的死亡,給豬產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。PEDV主要通過糞-口途徑進(jìn)行傳播,但最近報(bào)道稱PEDV也可通過空氣進(jìn)行長距離傳播,這意味著PEDV將對世界豬產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。截止目前,盡管已建立一系列針對PEDV感染的分子生物學(xué)檢測技術(shù),但尚無針對此類疾病有效疫苗和藥物,究其原因主要是因?yàn)椴《咀儺愃俣瓤?致病機(jī)理不明確,當(dāng)前可用細(xì)胞對PEDV的感染率低,以及部分地區(qū)毒株流行情況不詳導(dǎo)致不能及時(shí)有效的預(yù)防和治療該類疾病。針對此問題,本試驗(yàn)通過有限稀釋技術(shù)篩選對PEDV感染呈現(xiàn)出高敏感和高產(chǎn)量Vero細(xì)胞株;并通過該Vero細(xì)胞株分離鑒定我國西北地區(qū)暴發(fā)的PEDV毒株及特性;利用分離的病毒感染永生化豬小腸黏膜上皮細(xì)胞(SIEC),探究PEDV在靶細(xì)胞上的致病機(jī)理以及SSIEC細(xì)胞增殖的PEDV與Vero細(xì)胞增殖的PEDV病毒的差異。具體研究內(nèi)容與獲得結(jié)果如下:1.采用有限稀釋技術(shù)制備單克隆Vero細(xì)胞株,單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后經(jīng)間接免疫熒光技術(shù)篩選出感染率最高的細(xì)胞株作為母系細(xì)胞,重復(fù)以上操作,經(jīng)過三次逐級(jí)篩選最終獲得4株理想的單克隆細(xì)胞株,命名為Vero/G2A8C4、Vero/G2A8D4、Vero/G2A8E7和Vero/G2A8G6。研究發(fā)現(xiàn),1 MOI PEDV感染細(xì)胞96 h后,母系細(xì)胞感染率僅為15%,Vero/G2A8G6(Vero/G6)單克隆細(xì)胞感染率已達(dá)到100%;1 MOI PEDV感染120 h后,Vero細(xì)胞70~80%已脫落、死亡,而Vero/G6細(xì)胞60%以上細(xì)胞狀態(tài)良好,結(jié)構(gòu)完整,表明Vero/G6細(xì)胞的耐受能力更強(qiáng);0.1 MOI PEDV感染后,Vero/G6細(xì)胞在24 h時(shí)即可檢測到陽性細(xì)胞,而母系Vero細(xì)胞在感染72 h后才檢測到陽性細(xì)胞,表明在低病毒感染量下,Vero/G6細(xì)胞更有利于PEDV病毒的早期診斷。因此Vero/G6細(xì)胞將為PEDV的大量增殖、快速診斷、病毒學(xué)研究以及疫苗的制備等方面提供有利的生物工具,同時(shí)為預(yù)防該類疾病的潛在暴發(fā)提供了保障。2.從陜西、甘肅、青海、寧夏等西北地區(qū)的8個(gè)豬場共采集27份有腹瀉癥狀的病死仔豬小腸樣品。對腸道及內(nèi)容物提取病毒RNA,RT-PCR鑒定結(jié)果顯示,導(dǎo)致該地區(qū)仔豬病毒性腹瀉的主要病原體為PEDV,感染率高達(dá)92.6%,豬的傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的感染率為18.5%,輪狀病毒(RV)的感染率為0。利用Vero/G6細(xì)胞分離鑒定西北地區(qū)暴發(fā)的PEDV,獲得6株P(guān)EDV分離毒株,該6株病毒均能在Vero/G6細(xì)胞上穩(wěn)定傳至40代;種系發(fā)育分析顯示,5株分離毒株隸屬于經(jīng)典毒株,1株分離毒株為變異毒株;臨床癥狀以及病理變化發(fā)現(xiàn)經(jīng)典毒株NX1和變異毒株SX1對10日齡未斷奶仔豬均為強(qiáng)毒株。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)分離毒株能明顯提高腸系膜淋巴結(jié)中促凋亡因子BCL-G和JAB1基因的表達(dá)量以此促進(jìn)小腸絨毛上皮細(xì)胞的凋亡。3.選用已成功構(gòu)建的PEDV靶細(xì)胞SSIECs作為試驗(yàn)材料來研究分離毒株NX1感染后宿主細(xì)胞的變化。結(jié)果顯示,NX1感染SSIEC細(xì)胞后降低SSIEC細(xì)胞中Na~+-K~+-ATPases,Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPases酶的活性,抑制SSIEC細(xì)胞的增殖,同時(shí)也促進(jìn)SSIEC細(xì)胞的凋亡�；貧w試驗(yàn)顯示,SSIEC細(xì)胞中增殖的NX1毒株和Vero細(xì)胞中增殖的NX1毒株對7日齡未斷奶仔豬均為強(qiáng)毒株,仔豬的臨床癥狀,小腸病理變化以及測量數(shù)據(jù)表明SSIEC細(xì)胞中增殖的NX1毒株比在Vero細(xì)胞中增殖的NX1毒力高,具體表現(xiàn)在腹瀉癥狀和死亡癥狀出現(xiàn)早、腸系膜淋巴結(jié)腫脹明顯、周邊毛細(xì)血管充血更嚴(yán)重、腸系膜淋巴結(jié)中促凋亡因子BCL-G和JAB1基因的表達(dá)量高。本試驗(yàn)通過感染靶細(xì)胞系和宿主動(dòng)物來揭示PEDV感染的發(fā)病機(jī)制,為PEDV相關(guān)研究提供了準(zhǔn)確而有效的數(shù)據(jù)支持,同時(shí)也為該病的防治、疫苗制備以及深入研究提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 冠狀病毒的分類Fig. 1-1 Classification of coronavirusesPEDV整個(gè)基因組大約28 kb，由5’和3’非翻譯區(qū)（UTR）以及7個(gè)開放閱讀框組成（Hofmann and Wyler 1990；Kadoi et al. 2002）。分別是ORF1a、ORF1b、莢膜蛋白（S）、ORF3、囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）以及核蛋白（N）組成, 順序依次為5′UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3′UTR （ fig. 2 ）（ Chang et al. 2002 ； Cruz et al.2008a；Sun et al. 2007）。ORF1a 和 ORF1b 占據(jù)了5’末端三分之二的基因組長度，共編碼12個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1-7, 9-13），參與病毒的復(fù)制過程（Gao et al. 2013；Li et al.2012；Park et al. 2012）。ORF1a和ORF1b編碼產(chǎn)生pp1a和pp1bl兩種蛋白，該蛋白被蛋白酶水解形成Nsp1α、Nsp1β和Nsp2～12（Brian and Baric 2005；Utiger et al. 1995b）。

圖1-2 豬流行性腹瀉病毒基因組Fig.1-2 PEDV genome1.3 PEDV 的致病機(jī)理PEDV 感染機(jī)體后，病毒的增殖主要集中在豬的小腸絨毛上皮細(xì)胞（十二指腸、空腸和回腸）（Debouck et al. 1981；Ducatelle et al. 1982），感染后引起豬腸道上皮細(xì)胞的破壞、絨毛縮短、絨毛上皮細(xì)胞消化吸收功能降低、最終引起機(jī)體腹瀉、持續(xù)時(shí)間大約 1 個(gè)星期，其它臨床癥狀包括嘔吐、厭食、消瘦和死亡等（Duarte and Laude1994；Park et al. 2011a）。PEDV 可以感染所有年齡段的豬群，但是出生不到一星期的未斷奶仔豬感染率最高，臨床癥狀和病理變化也最為嚴(yán)重。斷奶仔豬的死亡率最低，，大約為 1～3%，到目前為止尚沒有育肥豬感染死亡的報(bào)道（Hou et al. 2007；Park et al.2007a；Sun et al. 2008）。先前報(bào)道稱 PEDV 僅在腸道內(nèi)部增殖，但是最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2684682