發(fā)布時間：2020-05-28 04:08

【摘要】：豬流行性腹瀉病(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由病原體豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染引起的,不同年齡段的豬均可感染,呈現(xiàn)出水樣腹瀉、嘔吐、水腫等臨床癥狀的一種急性腸道傳染病。目前PED已在全世界范圍內廣泛流行,造成大量仔豬的死亡,給豬產業(yè)造成重大經濟損失。PEDV主要通過糞-口途徑進行傳播,但最近報道稱PEDV也可通過空氣進行長距離傳播,這意味著PEDV將對世界豬產業(yè)構成嚴重威脅。截止目前,盡管已建立一系列針對PEDV感染的分子生物學檢測技術,但尚無針對此類疾病有效疫苗和藥物,究其原因主要是因為病毒變異速度快,致病機理不明確,當前可用細胞對PEDV的感染率低,以及部分地區(qū)毒株流行情況不詳導致不能及時有效的預防和治療該類疾病。針對此問題,本試驗通過有限稀釋技術篩選對PEDV感染呈現(xiàn)出高敏感和高產量Vero細胞株;并通過該Vero細胞株分離鑒定我國西北地區(qū)暴發(fā)的PEDV毒株及特性;利用分離的病毒感染永生化豬小腸黏膜上皮細胞(SIEC),探究PEDV在靶細胞上的致病機理以及SSIEC細胞增殖的PEDV與Vero細胞增殖的PEDV病毒的差異。具體研究內容與獲得結果如下:1.采用有限稀釋技術制備單克隆Vero細胞株,單克隆細胞擴大培養(yǎng)后經間接免疫熒光技術篩選出感染率最高的細胞株作為母系細胞,重復以上操作,經過三次逐級篩選最終獲得4株理想的單克隆細胞株,命名為Vero/G2A8C4、Vero/G2A8D4、Vero/G2A8E7和Vero/G2A8G6。研究發(fā)現(xiàn),1 MOI PEDV感染細胞96 h后,母系細胞感染率僅為15%,Vero/G2A8G6(Vero/G6)單克隆細胞感染率已達到100%;1 MOI PEDV感染120 h后,Vero細胞70~80%已脫落、死亡,而Vero/G6細胞60%以上細胞狀態(tài)良好,結構完整,表明Vero/G6細胞的耐受能力更強;0.1 MOI PEDV感染后,Vero/G6細胞在24 h時即可檢測到陽性細胞,而母系Vero細胞在感染72 h后才檢測到陽性細胞,表明在低病毒感染量下,Vero/G6細胞更有利于PEDV病毒的早期診斷。因此Vero/G6細胞將為PEDV的大量增殖、快速診斷、病毒學研究以及疫苗的制備等方面提供有利的生物工具,同時為預防該類疾病的潛在暴發(fā)提供了保障。2.從陜西、甘肅、青海、寧夏等西北地區(qū)的8個豬場共采集27份有腹瀉癥狀的病死仔豬小腸樣品。對腸道及內容物提取病毒RNA,RT-PCR鑒定結果顯示,導致該地區(qū)仔豬病毒性腹瀉的主要病原體為PEDV,感染率高達92.6%,豬的傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的感染率為18.5%,輪狀病毒(RV)的感染率為0。利用Vero/G6細胞分離鑒定西北地區(qū)暴發(fā)的PEDV,獲得6株PEDV分離毒株,該6株病毒均能在Vero/G6細胞上穩(wěn)定傳至40代;種系發(fā)育分析顯示,5株分離毒株隸屬于經典毒株,1株分離毒株為變異毒株;臨床癥狀以及病理變化發(fā)現(xiàn)經典毒株NX1和變異毒株SX1對10日齡未斷奶仔豬均為強毒株。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)分離毒株能明顯提高腸系膜淋巴結中促凋亡因子BCL-G和JAB1基因的表達量以此促進小腸絨毛上皮細胞的凋亡。3.選用已成功構建的PEDV靶細胞SSIECs作為試驗材料來研究分離毒株NX1感染后宿主細胞的變化。結果顯示,NX1感染SSIEC細胞后降低SSIEC細胞中Na~+-K~+-ATPases,Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPases酶的活性,抑制SSIEC細胞的增殖,同時也促進SSIEC細胞的凋亡�；貧w試驗顯示,SSIEC細胞中增殖的NX1毒株和Vero細胞中增殖的NX1毒株對7日齡未斷奶仔豬均為強毒株,仔豬的臨床癥狀,小腸病理變化以及測量數據表明SSIEC細胞中增殖的NX1毒株比在Vero細胞中增殖的NX1毒力高,具體表現(xiàn)在腹瀉癥狀和死亡癥狀出現(xiàn)早、腸系膜淋巴結腫脹明顯、周邊毛細血管充血更嚴重、腸系膜淋巴結中促凋亡因子BCL-G和JAB1基因的表達量高。本試驗通過感染靶細胞系和宿主動物來揭示PEDV感染的發(fā)病機制,為PEDV相關研究提供了準確而有效的數據支持,同時也為該病的防治、疫苗制備以及深入研究提供了理論基礎。
【圖文】：

圖 1-1 冠狀病毒的分類Fig. 1-1 Classification of coronavirusesPEDV整個基因組大約28 kb，由5’和3’非翻譯區(qū)（UTR）以及7個開放閱讀框組成（Hofmann and Wyler 1990；Kadoi et al. 2002）。分別是ORF1a、ORF1b、莢膜蛋白（S）、ORF3、囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）以及核蛋白（N）組成, 順序依次為5′UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3′UTR （ fig. 2 ）（ Chang et al. 2002 ； Cruz et al.2008a；Sun et al. 2007）。ORF1a 和 ORF1b 占據了5’末端三分之二的基因組長度，共編碼12個非結構蛋白（Nsp1-7, 9-13），參與病毒的復制過程（Gao et al. 2013；Li et al.2012；Park et al. 2012）。ORF1a和ORF1b編碼產生pp1a和pp1bl兩種蛋白，該蛋白被蛋白酶水解形成Nsp1α、Nsp1β和Nsp2～12（Brian and Baric 2005；Utiger et al. 1995b）。

圖1-2 豬流行性腹瀉病毒基因組Fig.1-2 PEDV genome1.3 PEDV 的致病機理PEDV 感染機體后，病毒的增殖主要集中在豬的小腸絨毛上皮細胞（十二指腸、空腸和回腸）（Debouck et al. 1981；Ducatelle et al. 1982），感染后引起豬腸道上皮細胞的破壞、絨毛縮短、絨毛上皮細胞消化吸收功能降低、最終引起機體腹瀉、持續(xù)時間大約 1 個星期，其它臨床癥狀包括嘔吐、厭食、消瘦和死亡等（Duarte and Laude1994；Park et al. 2011a）。PEDV 可以感染所有年齡段的豬群，但是出生不到一星期的未斷奶仔豬感染率最高，臨床癥狀和病理變化也最為嚴重。斷奶仔豬的死亡率最低，，大約為 1～3%，到目前為止尚沒有育肥豬感染死亡的報道（Hou et al. 2007；Park et al.2007a；Sun et al. 2008）。先前報道稱 PEDV 僅在腸道內部增殖，但是最近的一項研究發(fā)現(xiàn)
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651

【參考文獻】

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本文編號：2684682