發(fā)布時間：2020-05-27 22:09

【摘要】：弓形蟲病是一種感染率較高的人獸共患寄生蟲病,其病原為弓形蟲。弓形蟲屬于頂復門原蟲,含有一個與植物和藻類葉綠體同源的質體,稱為頂質體。頂質體對于弓形蟲的生存有著極其重要的作用。頂質體的丟失會導致弓形蟲的死亡�，F(xiàn)有研究表明,TgATG8部分定位于弓形蟲頂質體外膜。TgATG8以及調控TgATG8酯化的相關基因TgATG4、TgPROP2等基因缺失都會導致TgATG8無法在頂質體外膜定位,進而導致頂質體的丟失,影響弓形蟲的生存。在經典自噬發(fā)生過程中,ATG5-ATG12-ATG16復合物發(fā)揮類似E3泛素連接酶的作用,對于ATG8的酯化發(fā)揮至關重要的作用。然而目前TgATG8在頂質體外膜定位的分子機制尚不明確。本研究首先利用CRISPR/Cas9方法將SmFP-Myc插入到TgATG12的N端,構建SmFP-Myc-TgATG12蟲株,對TgATG12的亞細胞定位進行分析。然后,同樣利用CRISPR/Cas9方法,將生長素誘導降解因子(AID)插入到TgATG12的N端,構建TgATG12條件性敲除蟲株,分析TgATG12條件性缺失后對弓形蟲頂質體完整性以及對TgATG8在頂質體定位的影響。實驗結果表明,TgATG12定位于弓形蟲細胞質內,同時在頂質體周圍有明顯聚集。該基因缺失后導致TgATG8無法發(fā)生酯化,進而導致弓形蟲頂質體丟失,最終影響弓形蟲的生長復制能力。綜上所述,本研究利用AID條件性敲除技術對TgATG12調控TgATG8在弓形蟲頂質體外膜定位的分子機制進行了初步解析,為進一步研究自噬相關蛋白調控TgATG8在頂質體外膜定位的分子機制奠定基礎。
【圖文】：

科學院碩士學位論文 第二章 TgATG12 復合物的圖 2. 1 pCD-ΔTgATG12 敲除質粒示意圖Fig. 2. 1 Schematic structure of TgATG12 knockout plasmid 構建 SmFP-Myc-TgATG12 重組質粒過融合 PCR 將 TgATG12 起始密碼子前后各約 1000bp 的同源臂及 SmFP-M插入 pBluescript Ⅱ KS 載體中。同時，，將同源臂中的 gRNA 靶序列進行同表明成功構建 SmFP-Myc-TgATG12 重組質粒。以 SmFP-Myc-TgATG12 重P-Myc-TgATG12 片段，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗證明 SmFP-Myc-TgATG1. 3）。

圖 2. 1 pCD-ΔTgATG12 敲除質粒示意圖Fig. 2. 1 Schematic structure of TgATG12 knockout plasmidSmFP-Myc-TgATG12 重組質粒CR 將 TgATG12 起始密碼子前后各約 1000bp 的同源臂及 SmFluescript Ⅱ KS 載體中。同時，將同源臂中的 gRNA 靶序列進行構建 SmFP-Myc-TgATG12 重組質粒。以 SmFP-Myc-TgATG1gATG12 片段，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗證明 SmFP-Myc-TgA圖 2. 2 SmFP-Myc-TgATG12 重組質粒示意圖Fig. 2. 2 Schematic of SmFP-Myc-TgATG12 recombinant plasmid
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.72

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