【摘要】：奶牛的乳腺分支形態(tài)發(fā)育是完成泌乳功能的基本條件。乳腺分支結構可以通過提高乳腺腺泡組織的數(shù)量和分泌功能來提高奶牛乳產(chǎn)量。三維培養(yǎng)可以在體外誘導組織器官分支形態(tài)的發(fā)生,已經(jīng)是研究乳腺分支形態(tài)普遍使用的方法,在不同組織的三維培養(yǎng)中證實了FGF2可以誘導類器官分支形態(tài)發(fā)生。但是以往的研究多以小鼠等嚙齒類動物為主,并不能代替反芻動物的乳腺分支研究;關于FGF2調(diào)節(jié)奶牛乳腺分支的分子機理也鮮有報道。本研究利用從青春期奶牛乳腺中提取的類器官,以鑲嵌式培養(yǎng),用FGF2進行處理來建立奶牛乳腺分支培養(yǎng)模型;再利用轉錄組學,通過GO功能分析找到與FGF2調(diào)節(jié)奶牛乳腺分支形態(tài)發(fā)生有關的基因,并通過qPCR加以驗證;之后在奶牛乳腺分支培養(yǎng)過程中分別添加PD173074(FGFR1受體抑制劑)、LY-294002(PI3K抑制劑)、U0126(MEK/ERK抑制劑),通過光鏡觀察各組奶牛乳腺分支形態(tài)的變化,利用western blotting檢測各組主要信號通路蛋白的表達,利用qPCR技術檢測各組與奶牛乳腺分支相關基因的mRNA表達,由此確定FGF2調(diào)節(jié)奶牛乳腺分支的分子機理。結果如下:1)以鑲嵌式培養(yǎng)的青春期奶牛乳腺類器官,在FGF2處理下36 h時鏡下即可見分支形態(tài)出現(xiàn);且從36 h開始,FGF2組分支率顯著高于對照組(P0.05),表明奶牛乳腺分支培養(yǎng)模型成功建立。2)FGF2調(diào)節(jié)奶牛乳腺分支的轉錄組分析結果表明,與對照組比較,共獲得4427個差異顯著的基因(P0.05)。其中,FGF2組有1718個基因表達量上調(diào),2709個基因表達量下調(diào)。KEGG富集分析共有300個PATHWAY,其中包括參與ECM受體相互作用、局部黏著、MAPK信號轉導通路和PI3K-AKT信號通路等。GO功能富集分析共有206個差異顯著的GO功能條目(P0.05),其中與分支結構的形態(tài)發(fā)生有關的GO條目富集51個基因;與細胞黏附功能相關的GO條目富集27個基因。在這些基因中隨機選取DSG3、DSC3、CDH1、SLIT2、SPRY2、SMAD4、DDR1、ESRP2、SRC、MMP14、ILK進行qPCR驗證,發(fā)現(xiàn)與對照組比較,FGF2組的SPRY2、ILK和SMAD4mRNA表達水平顯著上調(diào)(P0.05)。DSG3、DSC3、CDH1、SLIT2、DDR1、ESRP2、SRC、MMP14mRNA表達水平顯著下調(diào)(P0.05)與轉錄組結果相一致。3)對對照組、FGF2組、FGF2+PD173074組、FGF2+LY-294002組、FGF2+U0126組形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),從36 h開始,與對照組比較,FGF2組和FGF2+LY-294002組的分支率顯著升高(P0.05);而與對照組比較,FGF2+PD173074組和FGF2+U0126組的分支率差異不顯著(P0.05)。Western blotting結果表明,FGF2+PD173074組的p-AKT和p-ERK蛋白表達顯著低于FGF2組(P0.05);FGF2+LY-294002組p-AKT蛋白表達顯著低于FGF2組(P0.05),p-ERK蛋白表達差異不顯著(P0.05);FGF2+U0126組p-AKT的蛋白表達與FGF2組相比差異不顯著(P0.05),p-ERK蛋白表達顯著低于FGF2組(P0.05)。qPCR結果表明,與對照組相比,FGF2組和FGF2+LY-294002組的DSG3、DSC3、CDH1mRNA表達水平顯著降低(P0.05),SPRY2、SLIT2 mRNA表達水平顯著上升(P0.05);與對照組相比,FGF2+PD173074組的DSG3、DSC3、CDH1、SLIT2 mRNA表達水平均無顯著差異(P0.05),SPRY2 mRNA表達水平顯著下降(P0.05);與對照組相比,FGF2+U0126組的DSG3、DSC3、CDH1、SPRY2、SLIT2 mRNA表達水平均無顯著差異(P0.05)。結論:FGF2能使鑲嵌在I型膠原中的青春期奶牛乳腺類器官產(chǎn)生分支形態(tài);在此過程中,FGF2與FGFR1受體結合,MAPK作為其下游與乳腺分支有關的信號通路,激活與分支相關基因SPRY2和SLIT2的表達,并降低細胞黏附相關基因DSG3、DSC3、CDH1的表達,從而調(diào)節(jié)奶牛乳腺分支形態(tài)的發(fā)生。
【圖文】：

圖 1-1 出生后乳腺發(fā)育階段的描述[7]Fig. 1-1 Depicting the stages of postnatal mammary gland development顯快與其他器官，這種異速生長一般會持續(xù) 9 個月。在這個階段上乳腺增大的速率是體率增長的 3.5 倍。導管分支和延伸的基本單位為終末導管小葉（Terminal duct lobular unLU），通過不斷穿透基質經(jīng)行擴展。

東北農(nóng)業(yè)大學理學碩士學位論文生長因子（Epidermal growth factor，EGF）、actor，，TGF)、成纖維細胞生長因子（Fibroblast g胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，F(xiàn)G纖維細胞生長因子信號通路與乳腺癌和乳腺發(fā)育和泌乳過程中，成纖維細胞生長因子在奶牛，導管上皮細胞和腺泡細胞等[17]。成纖維細胞生形成有缺陷的乳腺分支從而影響泌乳過程[18]。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S823

【參考文獻】

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本文編號：2681501