【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的母豬的繁殖障礙和生長(zhǎng)豬呼吸系統(tǒng)疾病為主要特征的高度接觸性傳染病。近年來(lái),我國(guó)PRRSV感染仍十分普遍,給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫是當(dāng)前防控PRRS的最有效的措施,對(duì)控制PRRS的發(fā)生和傳播起到了積極的作用。目前用于生產(chǎn)實(shí)踐中的疫苗主要有商品化的弱毒疫苗和滅活疫苗,但對(duì)其免疫效果缺乏較完善的評(píng)價(jià)體系,且各養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)對(duì)PRRS疫苗的使用效果也眾說(shuō)紛紜。已有研究證實(shí)PRRS弱毒疫苗與滅活疫苗聯(lián)合使用能產(chǎn)生更好的免疫保護(hù)效果,但對(duì)其免疫特性了解尚淺。因此,本試驗(yàn)采用商品化的經(jīng)典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株)和高致病性PRRS滅活疫苗(NVDC-JXA1株)以不同組合方式對(duì)仔豬免疫接種,通過(guò)疫苗免疫后的安全性評(píng)價(jià)、誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答效果進(jìn)行分析研究,以期為不同組合PRRS疫苗的免疫特性的研究奠定一定理論基礎(chǔ)和免疫程序提供可行依據(jù),為PRRS的有效防控提供科學(xué)指導(dǎo)。1.熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立根據(jù)GenBank中PRRSV基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)N基因擴(kuò)增的特異性引物,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后連接到pMD19-T載體上,構(gòu)建含有N基因片段的重組質(zhì)粒。采用SYBR GreenⅠ染料法進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行特異性、敏感性及重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示:所構(gòu)建的方法擴(kuò)增效率為1.063,相關(guān)系數(shù)R~2為0.999,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率值為㧟3.18,引物特異性強(qiáng),可檢測(cè)的最低核酸模板濃度為1.0×10~2copies/μL,比常規(guī)PCR敏感性高10倍,重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于1%。表明建立的熒光定量RT-PCR方法具有快速、特異性強(qiáng)、敏感性高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),可用于PRRSV感染(包括疫苗毒)的快速檢測(cè)。2.不同組合PRRS疫苗免疫仔豬的安全性評(píng)價(jià)篩選7~10日齡PRRSV抗原和抗體雙陰性的仔豬40頭,平均分為4組(3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照D組),其中試驗(yàn)組(試驗(yàn)A、B、C組)仔豬均為14日齡首免經(jīng)典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),35日齡分別對(duì)試驗(yàn)A組和B組二免高致病性PRRS滅活疫苗(NVDC-JXA1株)和經(jīng)典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),試驗(yàn)C組注射生理鹽水,對(duì)照D組于14日齡、35日齡均注射生理鹽水。通過(guò)以上不同組合方式免疫仔豬的臨床表現(xiàn)觀察,平均日增重測(cè)定,熒光定量RT-PCR方法監(jiān)測(cè)試驗(yàn)仔豬血清中PRRSV核酸和檢測(cè)主要組織器官中的PRRSV核酸,并觀察組織變化對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示:試驗(yàn)組仔豬接種PRRS疫苗后與對(duì)照D組相比未發(fā)現(xiàn)明顯的不良臨床表現(xiàn),采食狀況、精神狀態(tài)等無(wú)明顯差異,體溫均在正常范圍內(nèi),增重?zé)o明顯差異(P0.05);經(jīng)典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株)對(duì)14日齡仔豬首免后血清中PRRSV核酸持續(xù)時(shí)間為3周,35日齡(免疫后21 d)二次加強(qiáng)免疫后,未在血清中檢測(cè)到PRRSV核酸,至免疫后63 d仔豬主要組織器官中均未檢測(cè)到PRRSV核酸存在,僅有部分組織存在輕微病理學(xué)變化。3.不同組合PRRS疫苗誘導(dǎo)仔豬體液免疫應(yīng)答效果分析采用PRRSV N蛋白抗體和GP蛋白抗體檢測(cè)試劑盒分別對(duì)不同組合PRRS疫苗免疫后的不同階段的仔豬血清中特異性抗體變化情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示:試驗(yàn)組PRRSV N蛋白抗體在第14 d開(kāi)始轉(zhuǎn)為陽(yáng)性,GP蛋白抗體在第21 d才開(kāi)始轉(zhuǎn)為陽(yáng)性;免疫后35~63 d試驗(yàn)A、B兩組與試驗(yàn)C組、對(duì)照D組N蛋白抗體水平差異極顯著(P0.01)且C組與D組差異極顯著(P0.01);免疫后35 d,試驗(yàn)A、C兩組與B組GP蛋白抗體水平差異顯著(P0.05);免疫后42~63 d,試驗(yàn)A、B兩組與C組GP蛋白抗體水平差異極顯著(P0.01),其中試驗(yàn)A組與B組在免疫后56~63 d差異顯著(P0.05)。4.不同組合PRRS疫苗誘導(dǎo)仔豬細(xì)胞免疫應(yīng)答效果分析采用ELISA方法分別對(duì)不同組合PRRS疫苗免疫后的不同階段的仔豬血清中CD3、CD4和CD8分子表達(dá)量及細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-a、IL-2、IL-10、IL-12的含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示:首免PRRS弱毒疫苗21 d內(nèi),試驗(yàn)組血清中的CD3、CD4分子表達(dá)量呈現(xiàn)升高趨勢(shì),而CD8分子表達(dá)量試驗(yàn)組和對(duì)照D組均無(wú)明顯變化;免疫后第21 d加強(qiáng)免疫后,試驗(yàn)組血清中CD3、CD4分子表達(dá)量開(kāi)始出現(xiàn)緩慢下降后趨于平穩(wěn);免疫后35、42 d,試驗(yàn)C組血清中CD8分子表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)A、B組和對(duì)照D組(P0.05);PRRS疫苗免疫后,TNF-α與IFN-γ的含量變化規(guī)律相一致,均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì),其中第14 d時(shí)試驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照D組(P0.05),第21~42d時(shí)試驗(yàn)組均極顯著高于對(duì)照D組(P0.01);免疫后28 d內(nèi),IL-2的含量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì),其中在免疫后第14 d,試驗(yàn)組與對(duì)照D組差異顯著(P0.05);免疫28 d后,除了試驗(yàn)A組,試驗(yàn)B、C組均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì),其中免疫后49 d試驗(yàn)A組顯著高于其它組(P0.05);IL-10的含量整體呈現(xiàn)先緩慢下降后上升的趨勢(shì),但試驗(yàn)組與對(duì)照D組無(wú)顯著差異;IL-12的含量整體呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì),其中在免疫后21 d內(nèi),試驗(yàn)組IL-12的含量與對(duì)照D組無(wú)明顯差異,但免疫后35 d和56 d,試驗(yàn)組IL-12的含量與對(duì)照D組差異極顯著(P0.01),免疫后49 d,試驗(yàn)組IL-12的含量與對(duì)照D組差異顯著(P0.05)。綜上,本研究成功建立了檢測(cè)PRRSV的熒光定量RT-PCR方法;證實(shí)了不同組合PRRS疫苗免疫仔豬具有良好的安全性;首免經(jīng)典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株)和二免高致病性PRRS滅活苗(NVDC-JXA1株)的體液免疫應(yīng)答效果優(yōu)于單次及兩次經(jīng)典PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),且首免PRRS弱毒疫苗(CH-1R株)能有效誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)。
【圖文】：

013 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及整理，再行差異顯著性檢驗(yàn)，以 P＜異不顯著為判斷標(biāo)準(zhǔn)。法的建立性引物進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，T-PCR 產(chǎn)物純化、連接、轉(zhuǎn)，克隆片段與 GenBank 中 陽(yáng)性重組質(zhì)粒。測(cè)定陽(yáng)性M 1 2

貴州大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位論文3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果熒光定量 RT-PCR 最佳反應(yīng)體系為 25 μL：模板 cDNA 2 μL，SYBR GreenⅠMix 12.5μL，上、下游引物各為 1 μL，滅菌 ddH2O 8.5 μL；最佳反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5s，56 ℃ 30 s，，72 ℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)。以不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖 2 A），表達(dá)式為：Y= -3.18X+40.04，相關(guān)系數(shù) R2=0.999，擴(kuò)增效率為 1.063；依據(jù)循環(huán)數(shù)（Ct 值）和熒光強(qiáng)度的關(guān)系，繪制出擴(kuò)增曲線（見(jiàn)圖 2 B），擴(kuò)增曲線呈典型的S 型曲線，指數(shù)增長(zhǎng)期曲線接近平行，反映了 PCR 擴(kuò)增效率相近；熔解曲線為特異性單峰，Tm 值在 85 ℃左右，結(jié)果見(jiàn)圖 2 C。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.28

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王德康;;豬常用疫苗的使用方法[J];青海農(nóng)牧業(yè);2008年04期

2 王艷慧;;基層動(dòng)物防疫疫苗的管理及相關(guān)問(wèn)題思考[J];飼料博覽;2019年02期

3 張芳;李玉;;小兒二類疫苗接種現(xiàn)狀調(diào)查及其相關(guān)影響因素分析[J];南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2019年01期

4 瑪依努爾·阿不都克力木;梁靜;王培生;陳保林;尹鈺;;烏魯木齊市2012—2016年兒童入托入學(xué)預(yù)防接種查驗(yàn)情況[J];中國(guó)學(xué)校衛(wèi)生;2017年09期

5 陳曉曉;;兒童疫苗接種的問(wèn)題分析[J];科技風(fēng);2017年26期

6 楊媛;;流動(dòng)兒童疫苗接種的及時(shí)率的影響因素分析[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2018年17期

7 林玲;秦夢(mèng)怡;胡曉江;;高校場(chǎng)域?qū)W(xué)生疫苗接種的影響[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(社會(huì)科學(xué)版);2018年03期

8 錢文昌;劉淑兵;王正奎;;淺議疫苗[J];中學(xué)生物學(xué);2017年12期

9 程宇航;陳寧;;國(guó)外一些國(guó)家對(duì)疫苗是怎樣進(jìn)行監(jiān)管的[J];老區(qū)建設(shè);2018年15期

10 吳科穎;;兒童流感疫苗接種干預(yù)在疾病預(yù)防中的應(yīng)用價(jià)值研究[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2016年79期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 朱珊;方宇;常捷;余家樂(lè);張愉;計(jì)文婧;楊世民;;西安市家長(zhǎng)對(duì)兒童疫苗接種信心及影響因素調(diào)查[A];2018年中國(guó)藥學(xué)會(huì)藥事管理專業(yè)委員會(huì)年會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2018年

2 ;疫苗守護(hù)生命 第三章 疫苗的能與不能 第一節(jié) 接種疫苗安全有效[A];科技民生報(bào)告叢書——疫苗守護(hù)生命[C];2018年

3 ;疫苗守護(hù)生命 附錄 疫苗接種之“你問(wèn)我答” 第一問(wèn) 疫苗問(wèn)答之“接種疫苗,你知道嗎?”[A];科技民生報(bào)告叢書——疫苗守護(hù)生命[C];2018年

4 楊錫強(qiáng);;疫苗接種的不良反應(yīng)及其處理[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2010年

5 萬(wàn)朝敏;;疫苗接種在流感大流行群體防控中的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2010年

6 劉柏林;熊亞軍;唐有智;唐孝富;;合川區(qū)適齡兒童卡介疫苗接種成功率調(diào)查分析[A];重慶市預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2012年

7 ;疫苗守護(hù)生命 附錄 疫苗接種之“你問(wèn)我答” 第四問(wèn) 疫苗問(wèn)答之“關(guān)愛(ài)特殊疾病人群”[A];科技民生報(bào)告叢書——疫苗守護(hù)生命[C];2018年

8 ;疫苗守護(hù)生命 附錄 疫苗接種之“你問(wèn)我答” 第五問(wèn) 疫苗問(wèn)答之“世界這么大,你想去哪兒看看”[A];科技民生報(bào)告叢書——疫苗守護(hù)生命[C];2018年

9 陳賢希;陳波;;疫苗藥品管理與應(yīng)用存在的問(wèn)題及對(duì)策[A];2013年“全國(guó)醫(yī)院藥學(xué)（藥學(xué)服務(wù)與實(shí)踐）學(xué)術(shù)會(huì)議”論文集[C];2013年

10 ;疫苗守護(hù)生命 第一章 免疫系統(tǒng)守護(hù)人類健康 第三節(jié) 接種疫苗的歷史[A];科技民生報(bào)告叢書——疫苗守護(hù)生命[C];2018年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 時(shí)本 醫(yī)生;疫苗接種要指引更需追溯[N];健康報(bào);2019年

2 記者 阮曉瑩;廣西進(jìn)一步做好改革和完善疫苗管理體制工作[N];南寧日?qǐng)?bào);2019年

3 許諾;政策給力國(guó)產(chǎn)創(chuàng)新疫苗有望加速上市[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2019年

4 本報(bào)記者 陳燕飛;我國(guó)疫苗開(kāi)啟走向世界大門[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2018年

5 中國(guó)科學(xué)技術(shù)發(fā)展戰(zhàn)略研究院科技預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)研究所副研究員 張俊祥;“十二五”,疫苗產(chǎn)業(yè)要“突圍”[N];科學(xué)時(shí)報(bào);2010年

6 本報(bào)駐加拿大特約記者 陶短房 本報(bào)駐德國(guó)特約記者 青木 本報(bào)駐日本特約記者 黃文煒 本報(bào)記者 白云怡 范凌志;打消“疫苗恐慌”，各國(guó)都出重拳[N];環(huán)球時(shí)報(bào);2018年

7 胡浩;歐美民粹主義再掀反疫苗運(yùn)動(dòng)[N];環(huán)球時(shí)報(bào);2019年

8 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局信息中心 張s

本文編號(hào)：2682297