發(fā)布時(shí)間：2020-05-26 05:04

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)產(chǎn)生的一種高度傳染性豬疫病。臨床癥狀主要為繁殖母豬受精率降低,懷孕母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙以及不同年齡段豬呼吸道癥狀等。PRRS在全球范圍內(nèi)廣泛傳播,目前已成為威脅全球養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV病毒粒子是有囊膜的、其核酸組成為單股的正鏈RNA。該病毒具有高變異、免疫抑制和持續(xù)性感染等特性,導(dǎo)致該病難以防控。因此PRRSV一直是獸醫(yī)領(lǐng)域重點(diǎn)研究的對(duì)象。目前研究發(fā)現(xiàn),PRRSV通過必需受體CD163介導(dǎo)感染宿主細(xì)胞。CD163是清道夫受體家族的一個(gè)重要成員,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。其胞外區(qū)含有九個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(scavenger receptor cysteine-rich,SRCR)和兩個(gè)富含脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸基序(proline-serine-threonine,PST)。其中CD163胞外區(qū)SRCR5結(jié)構(gòu)域在PRRSV感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,SRCR6-9結(jié)構(gòu)域也發(fā)揮一定作用。然而,CD163 SRCR5和SRCR5-9結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)及其介導(dǎo)PRRSV感染宿主細(xì)胞重要氨基酸位點(diǎn)尚不清楚,阻礙了人們對(duì)PRRSV與CD163相互作用及PRRSV感染機(jī)制的深入理解,從而影響對(duì)PRRS的有效防控。因此本研究以PRRSV的必需受體CD163為研究對(duì)象,利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法解析豬源CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域(pCD163 SRCR5)、豬源CD163 SRCR5-9結(jié)構(gòu)域(pCD163 SRCR5-9)及不同種屬CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)并根據(jù)這些結(jié)構(gòu)鑒定其在PRRSV感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮作用的氨基酸位點(diǎn),為進(jìn)一步闡明PRRSV感染宿主細(xì)胞機(jī)制以及防控PRRS奠定基礎(chǔ),具有十分重大的科學(xué)意義與應(yīng)用價(jià)值。本論文主要在以下方面對(duì)PRRSV必需受體CD163結(jié)構(gòu)與功能展開研究:一、CD163介導(dǎo)PRRSV感染宿主細(xì)胞關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域SRCR5結(jié)構(gòu)解析及重要氨基酸位點(diǎn)鑒定本研究利用果蠅胚胎S2細(xì)胞和巴斯德畢氏酵母X-33成功表達(dá)純化了pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域重組蛋白,解析了其高分辨率(2.0埃和1.8埃)晶體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)具有一個(gè)明顯的長(zhǎng)loop區(qū)而且電荷具有特殊分布,不同于清道夫受體超級(jí)家族的其他成員。隨后,根據(jù)結(jié)構(gòu)對(duì)CD163分別進(jìn)行了6個(gè)位點(diǎn)的氨基酸單點(diǎn)突變。通過PRRSV感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染CD163第561位精氨酸突變體的PK-15細(xì)胞對(duì)PRRSV經(jīng)典毒株BJ-4和高致病性毒株HN07-1的感染能力明顯下降(p0.05)。最后,通過PRRSV的結(jié)合和侵入實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CD163第561位精氨酸突變體的PK15細(xì)胞對(duì)PRRSV結(jié)合量和侵入量明顯降低(p0.05),證實(shí)了豬源CD163第561位精氨酸在PRRSV感染過程中起著重要作用并且在CD163結(jié)合PRRSV的過程中發(fā)揮著重要作用。本研究在國(guó)內(nèi)外首先解析了CD163 SRCR結(jié)構(gòu),同時(shí)鑒定了其中介導(dǎo)PRRSV感染宿主細(xì)胞的重要氨基酸位點(diǎn),加深了人們對(duì)PRRSV感染機(jī)制的認(rèn)識(shí),并為該病毒的預(yù)防和控制提供了分子基礎(chǔ)。二、不同種屬CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)構(gòu)解析最新研究表明,CD163基因缺失編輯豬不感染1型和2型PRRSV,這證實(shí)了CD163是PRRSV必需受體。有趣的是,盡管CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域被證明在PRRSV感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用,但是用人CD163樣(CD163L1)SRCR8結(jié)構(gòu)域替代SRCR5結(jié)構(gòu)域的基因編輯豬雖然不感染1型PRRSV但仍然感染2型PRRSV。因此,推測(cè)CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域在PRRSV宿主細(xì)胞嗜性方面可能起著一定的作用,但其機(jī)制尚不完全清楚。本研究中利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化了猿猴CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域(M5)、人CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域(H5)和人CD163L1 SRCR8結(jié)構(gòu)域(H8)。隨后,對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。通過對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析,鑒定其中介導(dǎo)PRRSV感染的重要氨基酸位點(diǎn)。所有這些結(jié)果將為PRRSV宿主細(xì)胞嗜性提供線索。三、CD163介導(dǎo)PRRSV感染宿主細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)解析雖然pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域蛋白在PRRSV感染過程中起著關(guān)鍵性作用,但研究表明在PRRSV非易感細(xì)胞中僅表達(dá)pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域蛋白,該細(xì)胞并不感染PRRSV;而在該細(xì)胞中表達(dá)pCD163 SRCR5-9結(jié)構(gòu)域蛋白,則該細(xì)胞能感染PRRSV。另外,分別表達(dá)pCD163 SRCR5和pCD163SRCR5-9結(jié)構(gòu)域重組蛋白,發(fā)現(xiàn)pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域蛋白不能與病毒結(jié)合,而pCD163 SRCR5-9結(jié)構(gòu)域蛋白可以和PRRSV結(jié)合,這說明在PRRSV感染過程中,pCD163 SRCR5-9結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著一定的功能。本研究利用果蠅胚胎S2細(xì)胞成功表達(dá)了pCD163 SRCR5-9結(jié)構(gòu)域重組蛋白。通過多步驟純化獲得純度較高的蛋白。隨后進(jìn)行結(jié)晶及條件優(yōu)化,最后長(zhǎng)出了有衍射能力的晶體,其分辨率約為3.0埃。目前正在對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析并鑒定其中介導(dǎo)PRRSV感染的重要氨基酸位點(diǎn)。四、單克隆抗體篩選由于PRRSV具有ADE效應(yīng)(antibody-dependent enhancement)、抗原高度變異性等特性,目前缺乏行之有效的PRRS防控手段,從PRRSV受體出發(fā)進(jìn)行防控研究也許是一條新的思路。研究已證實(shí)pCD163是PRRSV感染宿主細(xì)胞的必需受體,其第五個(gè)SRCR結(jié)構(gòu)域?yàn)榻閷?dǎo)PRRSV感染的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。因此本研究設(shè)想,制備pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域重組蛋白單克隆抗體,篩選出能抑制PRRSV感染的特異性抗體。通過解析其晶體結(jié)構(gòu)及其與受體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)找出相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn),設(shè)計(jì)小分子或多肽抑制劑用于封閉CD163與PRRSV結(jié)合的位點(diǎn),從而抑制PRRSV的感染。另外,目前國(guó)內(nèi)外缺乏高效的pCD163商品化單克隆抗體,這給pCD163相關(guān)功能研究帶來諸多不便。本研究制備的pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域重組蛋白特異性單克隆抗體可為pCD163功能研究提供有利工具。
【圖文】：

圖 1-1 電子顯微鏡下 PRRSV 病毒粒子（圖片引自文獻(xiàn) Michael S et al.2009）Fig 1-1 Electron microscopy of PRRSV（from reference (Michael S et al.2009) ）RSV 基因組成RSV 基因組全長(zhǎng)約 15000 kb[37]，其 5’末端含有帽子結(jié)構(gòu)（被甲基化的），3’末端oly A）尾。另外，，5’末端含有約 200 nt 不等的非翻譯區(qū)（5’-untranslated region，有約 150 nt 不等的非翻譯區(qū)（3’ UTR）[38, 39]。有研究表明 5’ UTR 和 3’ UTR 對(duì) 錄和翻譯特別重要。RSV 基因組包括 11 個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF，如圖 l-2 所示）。O閱讀框 ORF1a 和 ORF1b。ORF1a 翻譯成 pp1a 多聚蛋白，ORF1b 通過核糖體移pp1ab 多聚蛋白[14]。病毒自身基因組編碼的蛋白酶將 pp1a 多聚蛋白和 pp1ab 多聚

圖 1-1 電子顯微鏡下 PRRSV 病毒粒子（圖片引自文獻(xiàn) Michael S et al.2009）Fig 1-1 Electron microscopy of PRRSV（from reference (Michael S et al.2009) ）RSV 基因組成RSV 基因組全長(zhǎng)約 15000 kb[37]，其 5’末端含有帽子結(jié)構(gòu)（被甲基化的），3’末端oly A）尾。另外，5’末端含有約 200 nt 不等的非翻譯區(qū)（5’-untranslated region，有約 150 nt 不等的非翻譯區(qū)（3’ UTR）[38, 39]。有研究表明 5’ UTR 和 3’ UTR 對(duì) 錄和翻譯特別重要。RSV 基因組包括 11 個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF，如圖 l-2 所示）。O閱讀框 ORF1a 和 ORF1b。ORF1a 翻譯成 pp1a 多聚蛋白，ORF1b 通過核糖體移pp1ab 多聚蛋白[14]。病毒自身基因組編碼的蛋白酶將 pp1a 多聚蛋白和 pp1ab 多聚
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 焦豫良;王淑軍;呂明生;房耀維;劉姝;;多結(jié)構(gòu)域酶的結(jié)構(gòu)域進(jìn)化關(guān)系[J];生命的化學(xué);2012年01期

2 劉永賓;高磊;李冬果;李霞;;共調(diào)控共互作蛋白結(jié)構(gòu)域的特征研究[J];中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志;2010年03期

3 馬云;李斌元;徐向紅;劉慧婷;賈瑜;何淑雅;;結(jié)構(gòu)域酵母三雜交誘餌載體的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化[J];中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥;2007年22期

4 王云華;病毒晚期結(jié)構(gòu)域研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊(cè);2004年01期

5 方福德;結(jié)構(gòu)域[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2004年05期

6 侯憲玉,馮佑民,張友尚;轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究——駱駝血清轉(zhuǎn)鐵蛋自的分離純化及其含單一鐵結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)域的制備和鑒定[J];生物化學(xué)雜志;1988年04期

7 侯憲玉,馮佑民;轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)域的研究及轉(zhuǎn)鐵蛋白的進(jìn)化[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1988年04期

8 陳金晶;趙曉麗;王真;陳琳峰;;含溴結(jié)構(gòu)域和額外終端域家族蛋白——表觀遺傳領(lǐng)域的新型治療靶點(diǎn)[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2017年08期

9 張美;李光偉;;纖維連接蛋白B結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)特征及其靶向藥物開發(fā)[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2017年08期

10 周亞麗;勞興珍;袁玲;柳萌;鄭珩;;免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的研究進(jìn)展[J];藥物生物技術(shù);2012年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 應(yīng)躍斌;宋見惠;陳樞青;;大腸桿菌T蛋白獨(dú)立結(jié)構(gòu)域的活性研究[A];浙江省生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2005年

2 邱興陽;尹里程;馮詩雨;周紅;;草魚白細(xì)胞介素12受體的分離鑒定[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨2018年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議摘要集[C];2018年

3 豐竹;張斌;劉謹(jǐn);周嚴(yán);周海軍;彭小忠;袁建剛;強(qiáng)伯勤;;人ENCI的cDNA的克隆、表達(dá)與功能研究[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第八屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2001年

4 段英俊;馮延瓊;石亞偉;;PICK1 PDZ結(jié)構(gòu)域配體藥物的篩選[A];第四屆泛環(huán)渤海生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2013年

5 張曉盼;焦雄;;基于結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)整合素相互作用的方法[A];第十一屆全國(guó)生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第十三屆全國(guó)生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議論文摘要匯編[C];2015年

6 姜國(guó)華;魏群;;鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基N端,C端結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和功能的研究[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第八屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2001年

7 金美芳;丁向明;仇灝;吳士良;周迎會(huì);;多肽:N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2原核與真核表達(dá)及其蓖麻蛋白樣結(jié)構(gòu)域同源建模[A];第八屆全國(guó)復(fù)合糖生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要論文集[C];2004年

8 尚福弟;張?chǎng)?趙彥翔;劉俊峰;;玉米抗病蛋白PSiP NB-ARC結(jié)構(gòu)域的重組表達(dá)和純化[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2018年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2018年

9 王長(zhǎng)振;楊俊濤;周宇;叢建波;先宏;郭林超;唐麗;吳可;;LSECtin CRD結(jié)構(gòu)域的運(yùn)行性研究[A];第十一次中國(guó)生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)暨第九屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)摘要集[C];2009年

10 呂丹;張君;張毓;陳慰峰;;UNC5CL表達(dá)調(diào)控及誘導(dǎo)表達(dá)[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 記者 王春;我學(xué)者認(rèn)知一個(gè)新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域[N];科技日?qǐng)?bào);2004年

2 醫(yī)學(xué)院;顏寧研究組在《自然》發(fā)文[N];新清華;2011年

3 雷諾島;十大失敗，一半在腫瘤[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王小滔;染色質(zhì)拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)及功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 馬紅芳;豬繁殖與呼吸綜合征病毒必需受體CD163結(jié)構(gòu)與功能研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 陳吉偉;整合多組學(xué)數(shù)據(jù)系統(tǒng)鑒定和解析人類分泌蛋白[D];華東師范大學(xué);2017年

4 周晨;Hsp90功能執(zhí)行的動(dòng)力學(xué)分子機(jī)制研究及其變構(gòu)抑制劑發(fā)現(xiàn)[D];中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所);2017年

5 張瀟潔;組蛋白讀體Sp100C及微管乙�；甫罷AT1的結(jié)構(gòu)功能研究[D];清華大學(xué);2016年

6 李魯申;I-BAR家族蛋白在癌細(xì)胞信號(hào)通路中的作用機(jī)制研究[D];東南大學(xué);2017年

7 羅雯;Axin激活JNK的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)制[D];廈門大學(xué);2004年

8 宋愛新;細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ可溶性結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)改變、轉(zhuǎn)換和功能研究[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

9 徐平龍;孤兒核受體hB1F轉(zhuǎn)錄激活分子機(jī)制的研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2004年

10 鄭起;人腦金屬硫蛋白MT3結(jié)構(gòu)對(duì)其性質(zhì)和功能的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 薛玉嬌;轉(zhuǎn)CryNGc基因玉米創(chuàng)制以及cry3和cry8基因分子改造[D];吉林大學(xué);2016年

2 張雪鈺;桃PpRBD1基因特征及功能分析[D];河北科技師范學(xué)院;2018年

3 石紅琴;Kindlin-2與Prdx4在腫瘤中的相互作用研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

4 蔡俊;設(shè)計(jì)、合成具有nNOS-Capon解偶聯(lián)活性的PDZ結(jié)構(gòu)域抑制劑及其生物活性研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

5 王雪松;CBP蛋白溴結(jié)構(gòu)域與不同抑制劑結(jié)合的理論研究[D];吉林大學(xué);2018年

6 張建建;DENN結(jié)構(gòu)域蛋白FAM45A的功能和機(jī)制[D];蘇州大學(xué);2018年

7 李根;海洋放線菌NRPS基因克隆及生物信息學(xué)分析[D];大連工業(yè)大學(xué);2017年

8 余敏;阿爾戈蛋白結(jié)構(gòu)域注釋及其三維結(jié)構(gòu)建模[D];電子科技大學(xué);2018年

9 張蕾;基于序列和結(jié)構(gòu)信息預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞高爾基體定位[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

10 曾盛源;UHRF2通過其RING結(jié)構(gòu)域與TIP60作用進(jìn)而調(diào)控組蛋白H3K9和H3K14乙�；絒D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2681318