【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)產(chǎn)生的一種高度傳染性豬疫病。臨床癥狀主要為繁殖母豬受精率降低,懷孕母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙以及不同年齡段豬呼吸道癥狀等。PRRS在全球范圍內(nèi)廣泛傳播,目前已成為威脅全球養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。PRRSV病毒粒子是有囊膜的、其核酸組成為單股的正鏈RNA。該病毒具有高變異、免疫抑制和持續(xù)性感染等特性,導(dǎo)致該病難以防控。因此PRRSV一直是獸醫(yī)領(lǐng)域重點研究的對象。目前研究發(fā)現(xiàn),PRRSV通過必需受體CD163介導(dǎo)感染宿主細胞。CD163是清道夫受體家族的一個重要成員,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。其胞外區(qū)含有九個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(scavenger receptor cysteine-rich,SRCR)和兩個富含脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸基序(proline-serine-threonine,PST)。其中CD163胞外區(qū)SRCR5結(jié)構(gòu)域在PRRSV感染宿主細胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,SRCR6-9結(jié)構(gòu)域也發(fā)揮一定作用。然而,CD163 SRCR5和SRCR5-9結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)及其介導(dǎo)PRRSV感染宿主細胞重要氨基酸位點尚不清楚,阻礙了人們對PRRSV與CD163相互作用及PRRSV感染機制的深入理解,從而影響對PRRS的有效防控。因此本研究以PRRSV的必需受體CD163為研究對象,利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法解析豬源CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域(pCD163 SRCR5)、豬源CD163 SRCR5-9結(jié)構(gòu)域(pCD163 SRCR5-9)及不同種屬CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)并根據(jù)這些結(jié)構(gòu)鑒定其在PRRSV感染宿主細胞過程中發(fā)揮作用的氨基酸位點,為進一步闡明PRRSV感染宿主細胞機制以及防控PRRS奠定基礎(chǔ),具有十分重大的科學(xué)意義與應(yīng)用價值。本論文主要在以下方面對PRRSV必需受體CD163結(jié)構(gòu)與功能展開研究:一、CD163介導(dǎo)PRRSV感染宿主細胞關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域SRCR5結(jié)構(gòu)解析及重要氨基酸位點鑒定本研究利用果蠅胚胎S2細胞和巴斯德畢氏酵母X-33成功表達純化了pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域重組蛋白,解析了其高分辨率(2.0埃和1.8埃)晶體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)具有一個明顯的長loop區(qū)而且電荷具有特殊分布,不同于清道夫受體超級家族的其他成員。隨后,根據(jù)結(jié)構(gòu)對CD163分別進行了6個位點的氨基酸單點突變。通過PRRSV感染實驗發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染CD163第561位精氨酸突變體的PK-15細胞對PRRSV經(jīng)典毒株BJ-4和高致病性毒株HN07-1的感染能力明顯下降(p0.05)。最后,通過PRRSV的結(jié)合和侵入實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CD163第561位精氨酸突變體的PK15細胞對PRRSV結(jié)合量和侵入量明顯降低(p0.05),證實了豬源CD163第561位精氨酸在PRRSV感染過程中起著重要作用并且在CD163結(jié)合PRRSV的過程中發(fā)揮著重要作用。本研究在國內(nèi)外首先解析了CD163 SRCR結(jié)構(gòu),同時鑒定了其中介導(dǎo)PRRSV感染宿主細胞的重要氨基酸位點,加深了人們對PRRSV感染機制的認識,并為該病毒的預(yù)防和控制提供了分子基礎(chǔ)。二、不同種屬CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)構(gòu)解析最新研究表明,CD163基因缺失編輯豬不感染1型和2型PRRSV,這證實了CD163是PRRSV必需受體。有趣的是,盡管CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域被證明在PRRSV感染宿主細胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用,但是用人CD163樣(CD163L1)SRCR8結(jié)構(gòu)域替代SRCR5結(jié)構(gòu)域的基因編輯豬雖然不感染1型PRRSV但仍然感染2型PRRSV。因此,推測CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域在PRRSV宿主細胞嗜性方面可能起著一定的作用,但其機制尚不完全清楚。本研究中利用真核表達系統(tǒng)表達純化了猿猴CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域(M5)、人CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域(H5)和人CD163L1 SRCR8結(jié)構(gòu)域(H8)。隨后,對其晶體結(jié)構(gòu)進行解析。通過對結(jié)構(gòu)進行比較分析,鑒定其中介導(dǎo)PRRSV感染的重要氨基酸位點。所有這些結(jié)果將為PRRSV宿主細胞嗜性提供線索。三、CD163介導(dǎo)PRRSV感染宿主細胞功能結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)解析雖然pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域蛋白在PRRSV感染過程中起著關(guān)鍵性作用,但研究表明在PRRSV非易感細胞中僅表達pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域蛋白,該細胞并不感染PRRSV;而在該細胞中表達pCD163 SRCR5-9結(jié)構(gòu)域蛋白,則該細胞能感染PRRSV。另外,分別表達pCD163 SRCR5和pCD163SRCR5-9結(jié)構(gòu)域重組蛋白,發(fā)現(xiàn)pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域蛋白不能與病毒結(jié)合,而pCD163 SRCR5-9結(jié)構(gòu)域蛋白可以和PRRSV結(jié)合,這說明在PRRSV感染過程中,pCD163 SRCR5-9結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著一定的功能。本研究利用果蠅胚胎S2細胞成功表達了pCD163 SRCR5-9結(jié)構(gòu)域重組蛋白。通過多步驟純化獲得純度較高的蛋白。隨后進行結(jié)晶及條件優(yōu)化,最后長出了有衍射能力的晶體,其分辨率約為3.0埃。目前正在對其結(jié)構(gòu)進行解析并鑒定其中介導(dǎo)PRRSV感染的重要氨基酸位點。四、單克隆抗體篩選由于PRRSV具有ADE效應(yīng)(antibody-dependent enhancement)、抗原高度變異性等特性,目前缺乏行之有效的PRRS防控手段,從PRRSV受體出發(fā)進行防控研究也許是一條新的思路。研究已證實pCD163是PRRSV感染宿主細胞的必需受體,其第五個SRCR結(jié)構(gòu)域為介導(dǎo)PRRSV感染的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。因此本研究設(shè)想,制備pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域重組蛋白單克隆抗體,篩選出能抑制PRRSV感染的特異性抗體。通過解析其晶體結(jié)構(gòu)及其與受體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)找出相應(yīng)結(jié)合位點,設(shè)計小分子或多肽抑制劑用于封閉CD163與PRRSV結(jié)合的位點,從而抑制PRRSV的感染。另外,目前國內(nèi)外缺乏高效的pCD163商品化單克隆抗體,這給pCD163相關(guān)功能研究帶來諸多不便。本研究制備的pCD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域重組蛋白特異性單克隆抗體可為pCD163功能研究提供有利工具。
【圖文】：

圖 1-1 電子顯微鏡下 PRRSV 病毒粒子（圖片引自文獻 Michael S et al.2009）Fig 1-1 Electron microscopy of PRRSV（from reference (Michael S et al.2009) ）RSV 基因組成RSV 基因組全長約 15000 kb[37]，其 5’末端含有帽子結(jié)構(gòu)（被甲基化的），3’末端oly A）尾。另外，，5’末端含有約 200 nt 不等的非翻譯區(qū)（5’-untranslated region，有約 150 nt 不等的非翻譯區(qū)（3’ UTR）[38, 39]。有研究表明 5’ UTR 和 3’ UTR 對 錄和翻譯特別重要。RSV 基因組包括 11 個開放閱讀框（open reading frame，ORF，如圖 l-2 所示）。O閱讀框 ORF1a 和 ORF1b。ORF1a 翻譯成 pp1a 多聚蛋白，ORF1b 通過核糖體移pp1ab 多聚蛋白[14]。病毒自身基因組編碼的蛋白酶將 pp1a 多聚蛋白和 pp1ab 多聚

圖 1-1 電子顯微鏡下 PRRSV 病毒粒子（圖片引自文獻 Michael S et al.2009）Fig 1-1 Electron microscopy of PRRSV（from reference (Michael S et al.2009) ）RSV 基因組成RSV 基因組全長約 15000 kb[37]，其 5’末端含有帽子結(jié)構(gòu)（被甲基化的），3’末端oly A）尾。另外，5’末端含有約 200 nt 不等的非翻譯區(qū)（5’-untranslated region，有約 150 nt 不等的非翻譯區(qū)（3’ UTR）[38, 39]。有研究表明 5’ UTR 和 3’ UTR 對 錄和翻譯特別重要。RSV 基因組包括 11 個開放閱讀框（open reading frame，ORF，如圖 l-2 所示）。O閱讀框 ORF1a 和 ORF1b。ORF1a 翻譯成 pp1a 多聚蛋白，ORF1b 通過核糖體移pp1ab 多聚蛋白[14]。病毒自身基因組編碼的蛋白酶將 pp1a 多聚蛋白和 pp1ab 多聚
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651

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本文編號：2681318