【摘要】：睪丸支持細(xì)胞(Sertoli Cell,SC)是啟動(dòng)性機(jī)能發(fā)育和維持成年精子發(fā)生的上皮細(xì)胞,與生精細(xì)胞直接接觸并為生精細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng),分泌多種細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞分化,維持精子發(fā)生,吞噬精子發(fā)生過(guò)程中的殘余胞質(zhì)和分泌睪丸液等重要功能。作為一種終末分化細(xì)胞,支持細(xì)胞在性成熟后就停止增殖。每一個(gè)支持細(xì)胞滋養(yǎng)的生精細(xì)胞數(shù)量有限,所以支持細(xì)胞增殖數(shù)量直接影響成年動(dòng)物睪丸大小和生精數(shù)量,而性成熟后支持細(xì)胞維持生精微環(huán)境的穩(wěn)態(tài),決定了動(dòng)物精子的質(zhì)量。因此,支持細(xì)胞增殖與分泌直接影響著公豬的繁殖力。RNA結(jié)合蛋白QKI是STAR家族成員之一,具有RNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活功能。主要通過(guò)特異性結(jié)合3’UTR中含有QRE原件(QRE序列:ACUAAY-N(1-20)-UAAY,Y=U/C)的Pre-mRNA和成熟的mRNA,以參與調(diào)控多種組織發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探究QKI在豬睪丸未成熟支持細(xì)胞中的靶基因,進(jìn)而研究QKI對(duì)支持細(xì)胞增殖和分泌因子的影響,結(jié)果可為研究支持細(xì)胞增殖和分泌功能的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。1.支持細(xì)胞的分離、純化與標(biāo)志蛋白的鑒定首先,采集21日齡仔豬睪丸,用兩步酶消化的方法獲得細(xì)胞,并用差異性貼壁的方法純化細(xì)胞;通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察,細(xì)胞形狀呈橢圓形或圓形,有多個(gè)突起,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,200倍和400倍顯微鏡下可清晰觀察到細(xì)胞核周邊有兩個(gè)衛(wèi)星核小體;通過(guò)計(jì)算免疫熒光標(biāo)記支持細(xì)胞標(biāo)志蛋白GATA-4、WT-1和FASL在細(xì)胞中的染色比率,確定支持細(xì)胞的純度接近100%;通過(guò)未成熟支持細(xì)胞標(biāo)志蛋白KRT-18,最終確定分離純化的細(xì)胞為豬睪丸未成熟支持細(xì)胞。2.QKI靶基因mRNA序列分析與RIP-seq驗(yàn)證隨后,我們通過(guò)Ensemble網(wǎng)站導(dǎo)出豬基因組所有mRNA的3’UTR,得到5445個(gè)基因的3’UTR中含有QRE元件。又采用RIP-seq技術(shù),用QKI抗體特異性識(shí)別“QKI-mRNA”的復(fù)合體,經(jīng)蛋白酶消化和純化后,進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,差異表達(dá)2倍以上的基因有3551個(gè)。兩種結(jié)果交集分析,既含有QRE元件,又在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中出現(xiàn)的mRNA有1379個(gè),其中包括前期研究驗(yàn)證過(guò)的7個(gè)基因,再隨機(jī)選取10個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證,同轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。通過(guò)KEGG和Go分析,發(fā)現(xiàn)QKI結(jié)合的mRNA有13個(gè)基因集中參與細(xì)胞周期(cell cycle)通路中,其中包括與增殖有密切關(guān)系的PCNA。這意味著QKI可能對(duì)支持細(xì)胞周期和增殖有影響。3.QKI對(duì)支持細(xì)胞增殖與分泌因子影響的研究然后,將過(guò)表達(dá)載體和干擾載體分別轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞,過(guò)表達(dá)QKI組細(xì)胞周期通路中PCNA的mRNA含量顯著增加(P0.01);干擾QKI組PCNA的含量顯著降低(P0.01);檢測(cè)QKI對(duì)細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示當(dāng)過(guò)表達(dá)QKI時(shí),pBI-CMV3-QKI組支持細(xì)胞的S期明顯高于對(duì)照組pBI-CMV3(P0.05),而干擾QKI表達(dá)時(shí),shQKI組支持細(xì)胞的S期明顯低于對(duì)照組shNC(P0.05);通過(guò)分析QKI對(duì)細(xì)胞活力的影響,發(fā)現(xiàn)pBI-CMV3-QKI組與對(duì)照組pBI-CMV3相比,在72h時(shí)細(xì)胞活力明顯增強(qiáng),細(xì)胞增殖加快,差異顯著(P0.01),而干擾QKI后,在72h時(shí)shQKI組細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組shNC,差異顯著(P0.01);最后測(cè)定QKI對(duì)細(xì)胞因子ABP、EGF、GDNF和IGF-1分泌的影響,當(dāng)過(guò)表達(dá)QKI時(shí),pBI-CMV3-QKI組EGF、GDNF和IGF-1分泌顯著高于pBI-CMV3組,而對(duì)于ABP的分泌無(wú)顯著差異。結(jié)論:在豬睪丸未成熟支持細(xì)胞中,QKI通過(guò)結(jié)合細(xì)胞周期多個(gè)相關(guān)基因的mRNA,促進(jìn)細(xì)胞增殖,同時(shí)具有促進(jìn)GDNF、IGF-1和EGF分泌的功能,其調(diào)控的分子機(jī)制還有待深入研究。
【圖文】：

圖 1 支持細(xì)胞從胎兒、性發(fā)育期到成年的發(fā)育成熟過(guò)程中，成熟或不成熟的蛋白質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)的變化Figure 1 Schematic diagram illustrating normal (and abnormal) maturationaldevelopment of Sertoli cells from fetal life through puberty to adulthood, and the

圖 2 人、獼猴、恒河猴和大鼠的生長(zhǎng)時(shí)期與支持細(xì)胞的增殖曲線gure 2 Schematic diagram illustrating timing of proliferation of Sertoli celmans, rhesus and marmoset monkeys, and rats in relation to birth, the neonperiod and puberty.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S828

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本文編號(hào)：2680381