【摘要】：目的:犢牛腹瀉是牛養(yǎng)殖業(yè)中最常見的具有多發(fā)性和傳染性的疾病之一,目前主要通過抗生素防治該病,但由于抗生素的長(zhǎng)期、大量使用,造成耐藥菌株的產(chǎn)生,不僅降低了抗生素的治療效果,還帶來了藥物殘留等問題,間接危害了人們的身體健康。因此,研究者們一直在尋找相關(guān)替換或輔助性藥物的研究,其中抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)的研究備受研究者廣泛的關(guān)注。但由于犢牛是大型經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,直接以犢牛作為試驗(yàn)對(duì)象會(huì)存在很多問題,而小鼠因其個(gè)體小、繁殖周期短經(jīng)常作為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要模型動(dòng)物,因此,可以把小鼠作為犢牛腹瀉感染、發(fā)病和治療等研究的替換模型動(dòng)物。抗菌肽是生物體防御外界病原體侵襲產(chǎn)生的一類具有抗菌作用的小分子多肽,其抑菌作用機(jī)制不同于抗生素,不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留,也不易產(chǎn)生耐藥性。生物界中數(shù)量龐大易繁殖的蠅蛆體內(nèi)含有豐富的抗菌肽,使其在腐物、糞便和垃圾等含有大量細(xì)菌的惡劣環(huán)境中還能健康地生長(zhǎng)繁殖。因此,采用家蠅幼蟲-蠅蛆做為實(shí)驗(yàn)材料,利用犢牛腹瀉糞便中分離的致病性大腸桿菌,誘導(dǎo)蠅蛆產(chǎn)生高表達(dá)量的蠅蛆抗菌肽,為了研究蠅蛆抗菌肽替換或輔助抗生素對(duì)致病性大腸桿菌引起犢牛腹瀉的治療效果,本試驗(yàn)從犢牛腹瀉糞便中分離出致病大腸桿菌,將分離出的大腸桿菌灌胃小鼠建立大腸桿菌致小鼠腹瀉的病理模型,再用蠅蛆抗菌肽治療腹瀉的小鼠,觀察在治療過程中小鼠臨床癥狀的變化,檢測(cè)小鼠十二指腸中的腫瘤壞死因子(TNF-α)含量和大腸桿菌和乳酸桿菌菌落數(shù)的變化情況,以及小鼠血清中IL-6的含量及小鼠腹瀉治愈率等,為今后將蠅蛆抗菌肽替換或輔助抗生素治療致病大腸桿菌引起的犢牛腹瀉提供理論依據(jù)。方法:試驗(yàn)一:致犢牛腹瀉大腸桿菌的分離及鑒定無菌采集10日齡犢牛腹瀉的糞便,進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng),對(duì)分離菌株進(jìn)行染色鏡檢、PCR鑒定及分離菌株對(duì)小鼠致病性的試驗(yàn)研究。試驗(yàn)二:蠅蛆抗菌肽對(duì)致犢牛腹瀉大腸桿菌抑菌活性的研究(1)蠅蛆抗菌肽的粗提及純化;(2)利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蠅蛆抗菌肽的濃度;(3)蠅蛆抗菌肽最小抑菌濃度測(cè)定;(4)采用K-B紙片法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行蠅蛆抗菌肽和恩諾沙星的敏感性試驗(yàn)。試驗(yàn)三:犢牛腹瀉大腸桿菌性小鼠腹瀉模型的建立將從犢牛腹瀉糞便中分離出來的致病大腸桿菌,制備成不同濃度的大腸桿菌懸浮液灌胃小鼠,通過記錄察小鼠的臨床癥狀、小鼠體重變化和測(cè)定腹瀉小鼠糞便中大腸桿菌數(shù)、小鼠死亡率和腹瀉率,進(jìn)行構(gòu)建大腸桿菌性小鼠腹瀉模型。試驗(yàn)四:蠅蛆抗菌肽對(duì)大腸桿菌性小鼠腹瀉治療效果的研究(1)將試驗(yàn)小鼠分成4組,為空白對(duì)照組,生理鹽水組、抗生素(恩諾沙星)組及蠅蛆抗菌肽治療組,于治療1d、3d、5d采集各試驗(yàn)組小鼠十二指腸組織樣品,觀察組織病理變化及治療效果;(2)通過ELISA法檢測(cè)小鼠十二指腸中TNF-α的含量和大腸桿菌及乳酸桿菌菌落數(shù)。(3)通過ELIS測(cè)定腹瀉小鼠血清中IL-6的含量。結(jié)果:1.對(duì)犢牛糞便中分離出來的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、染色鏡檢、PCR鑒定以及小鼠致病性等試驗(yàn),獲得了致犢牛腹瀉的致病性大腸桿菌。2.蠅蛆抗菌肽對(duì)犢牛腹瀉大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)的結(jié)果表明,蠅蛆抗菌肽對(duì)犢牛腹瀉大腸桿菌的抑菌圈為(12.72±0.69mm)低于抗生素(恩諾沙星)的抑菌圈(19.87±0.51mm);采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)經(jīng)犢牛腹瀉大腸桿菌誘導(dǎo)的蠅蛆抗菌肽和抗生素(恩諾沙星)對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為2.19ug/mL、1.56ug/mL。3.給小鼠灌胃1×10~8CFU/mL、2×10~8CFU/mL、3×10~8CFU/mL、4×10~8CFU/mL、5×10~8CFU/mL的大腸桿菌菌懸液,通過小鼠的臨床癥狀變化和體重的下降以及腹瀉小鼠糞便中大腸桿菌數(shù)量的增多、腹瀉率和死亡率的升高,篩選出致小鼠腹瀉的大腸桿菌濃度為4×10~8CFU/mL,成功構(gòu)建小鼠腹瀉病理模型。4.應(yīng)用蠅蛆抗菌肽治療小鼠腹瀉模型,分別于治療1d、3d、5d采集小鼠的十二指腸組織,檢測(cè)小鼠十二指腸中TNF-α、小鼠血清IL-6的含量和小鼠十二指腸中大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)以及小鼠腹瀉治愈率。(1)通過ELISA方法檢測(cè)小鼠十二指腸中TNF-α的含量結(jié)果顯示,與生理鹽水組比較,在治療的第1d、3d、5d,蠅蛆抗菌肽治療組的小鼠十二指腸中TNF-α的含量顯著下降(P0.01);(2)采用蠅蛆抗菌肽治療腹瀉小鼠,對(duì)小鼠十二指腸中大腸桿菌及乳酸桿菌數(shù)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),治療過程中,1d、3d、5d的蠅蛆抗菌肽治療組的小鼠十二指腸中大腸桿菌數(shù)呈極顯著降低(P0.01),小鼠十二指腸中的乳酸桿菌數(shù)呈極顯著升高趨勢(shì)(P0.01)。(3)治療結(jié)束后,通過ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-6的含量結(jié)果顯示,抗生素治療組和蠅蛆抗菌肽治療組IL-6的含量顯著低于生理鹽水組(P0.05)。(4)腹瀉小鼠十二指腸中的大腸桿菌數(shù)推斷小鼠的治愈率的結(jié)果顯示,生理鹽水治療組小鼠的治愈率為27%,抗菌肽治療組為46%,抗生素(恩諾沙星)治療組為60%。結(jié)論:蠅蛆抗菌肽對(duì)犢牛腹瀉大腸桿菌性腹瀉小鼠有一定的治療效果,雖然蠅蛆抗菌肽的治愈率低于抗生素(恩諾沙星)組,但蠅蛆抗菌肽和抗生素同樣對(duì)腹瀉小鼠有治療作用,說明蠅蛆抗菌肽可以用于治療腹瀉小鼠。
【圖文】：

革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

蛋白濃度側(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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1 普紹林;石於友;李美荃;宋聰;劉寧;楊榮麗;姚俊;;致犢牛腹瀉大腸桿菌云南株的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J];云南畜牧獸醫(yī);2015年03期

2 潘靈鋒;趙雙雙;;家蠅幼蟲抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)及抗菌活性研究[J];湖北師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年02期

3 盧俊鑫;楊金波;鄺哲師;趙祥杰;葉明強(qiáng);潘木水;;豬源性PR39抗菌肽對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、血清免疫指標(biāo)和腸道菌群的影響[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2014年06期

4 姚遠(yuǎn);匡偉;黃忠陽(yáng);郗正林;王冰心;何宗亮;王潤(rùn)之;;抗菌肽天蠶素對(duì)雞生長(zhǎng)性能、腸道黏膜形態(tài)、盲腸菌群及免疫功能的影響[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2014年02期

5 王俊民;;黃連地丁湯治療犢牛腹瀉的觀察[J];當(dāng)代畜牧;2013年21期

6 李茵;溫穎;鄭東翔;;人工合成抗菌肽對(duì)口腔腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲抑制及促凋亡作用[J];中國(guó)腫瘤;2013年06期

7 武玉飛;劉海燕;高明明;周鋼;王俊剛;申紅;;大腸桿菌刺激蠅蛆產(chǎn)生抗菌肽濃度和抑菌活性的測(cè)定[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年07期

8 竇茂鑫;吳濤;;不同類型益生素對(duì)斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系、pH和揮發(fā)性鹽基氮的影響[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2013年02期

9 蘇滿秀;王立峰;代志軍;袁哲明;柏連陽(yáng);;多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)表征與抗菌肽QSAM建模[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2012年11期

10 劉莉如;楊開倫;滑靜;劉亭婷;王曉霞;;抗菌肽對(duì)蛋用仔公雞生長(zhǎng)性能、免疫指標(biāo)及空腸組織相關(guān)細(xì)胞因子基因mRNA表達(dá)的影響[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2012年07期

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1 汪以真;豬乳鐵蛋白基因克隆、表達(dá)及其產(chǎn)物對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)、免疫和抗菌肽基因表達(dá)影響的研究[D];浙江大學(xué);2004年

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1 王志濤;蠅蛆抗菌肽對(duì)白痢病雞小腸黏膜免疫的影響[D];石河子大學(xué);2017年

2 牛耀祖;寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌的分型鑒定及其主要毒力基因檢測(cè)[D];寧夏大學(xué);2016年

3 姚媛媛;致犢牛腹瀉病腸道大腸桿菌的分離鑒定及蒙藥復(fù)方對(duì)其抗菌效果研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 黃偉光;蠅蛆蛋白的提取及其抗菌活性研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2011年

5 馬治宇;乳酸菌及其培養(yǎng)液對(duì)肉雞生產(chǎn)性能、腸道菌群及腸道結(jié)構(gòu)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：2680113