【摘要】：圍產(chǎn)期奶牛易發(fā)能量負平衡,游離脂肪酸(NEFA)被大量釋放在肝臟內(nèi)酯化形成甘油三酯蓄積。極低密度脂蛋白(VLDL)將甘油三酯運出肝外是清除蓄積的主要方式,膽固醇是合成VLDL的主要成分。然而,能量負平衡導致的奶牛肝臟內(nèi)膽固醇代謝調(diào)節(jié)機制仍未清晰。據(jù)此,本研究通過奶牛血液膽固醇含量與其他生化指標的分析,明確膽固醇對圍產(chǎn)期奶牛健康的影響特征;通過體外培養(yǎng)犢牛肝細胞添加NEFA模擬能量負平衡狀態(tài)并添加膽固醇,運用蛋白質(zhì)組學與代謝組學技術(shù)來闡明膽固醇在NEFA介導的犢牛肝細胞脂質(zhì)沉積中的作用,揭示膽固醇對能量負平衡時肝脂代謝的調(diào)控機制,對圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝發(fā)病機理及防治措施有重要意義。本研究包括四個實驗:1)在黑龍江某集約化牛場采集產(chǎn)前2周到產(chǎn)后14天奶牛血液。依據(jù)產(chǎn)前2周血中膽固醇(TC)含量將試驗牛分成高血膽固醇組(14頭)和低血膽固醇組(14頭),對試驗牛血中能量、血脂、肝功等指標水平進行組間獨立樣本T檢驗和Pearson相關(guān)分析。2)應用兩步膠原酶灌流法分離犢牛肝細胞,體外培養(yǎng)48 h后,饑餓培養(yǎng)6 h,添加1.2 m M NEFA,繼續(xù)培養(yǎng)細胞12 h,建立肝細胞脂質(zhì)沉積模型。采用時間梯度與密度梯度法,通過對NEFA、TG、AST和GLO等肝細胞脂代謝敏感指標分析,確定膽固醇添加的最佳濃度及最佳時間。3)在確立膽固醇添加的時間及濃度后,應用iTRAQ技術(shù)檢測(膽固醇組與空白組、酸+醇組與游離脂肪酸組)犢牛肝細胞樣品,獲得組間的差異蛋白,再進行GO富集與KEGG分析,確定差異蛋白的代謝通路。4)應用GC/MS技術(shù)檢測(膽固醇組與空白組、酸+醇組與游離脂肪酸組)犢牛肝細胞樣品,獲得組間的差異代謝物,再進行生物信息學分析,確定差異代謝物的代謝通路。結(jié)果顯示:1)高血膽固醇(H)組奶牛血液TC水平極顯著高于低血膽固醇組(L)奶牛(P0.01)。H組奶牛血液TG水平在產(chǎn)前2周、產(chǎn)前1周、分娩當天顯著低于L組(P0.05);在產(chǎn)后7天極顯著低于L組(P0.01)。H組奶牛血液HDL-C和LDL-C水平顯著高于L組(P0.01)。在產(chǎn)前1周、分娩當天和產(chǎn)后7天H組與L組相比NEFA顯著降低(P0.05)。在分娩當天H組與L組相比Mg水平顯著升高(P0.05)。在產(chǎn)后7天H組與L組相比AST顯著降低(P0.05);在產(chǎn)前1周、分娩當天和產(chǎn)后7天H組與L組相比Ca顯著升高(P0.05)。2)通過對NEFA誘導的肝細胞脂質(zhì)沉積中添加不同濃度膽固醇的結(jié)果顯示,添加膽固醇可以緩解肝脂沉積狀態(tài),膽固醇最佳添加濃度與時間為50μm/d L和6 h。3)對iTRAQ檢測的結(jié)果進行GO分析,膽固醇組與空白組相比篩選了差異蛋白138個,其中有50個表達上調(diào)(ratio1.2,P0.05)的蛋白,88個表達下調(diào)(ratio0.83,P0.05)的蛋白。酸+醇組與游離脂肪酸組相比篩選了差異蛋白66個,其中有41個表達上調(diào)(ratio1.2,P0.05)的蛋白,25個表達下調(diào)(ratio0.83,P0.05)的蛋白。上調(diào)蛋白有3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)、己糖激酶(HK2)、山梨醇脫氫酶(SORD)和載脂蛋白C-III(APOC3)等。下調(diào)蛋白有脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPS)等。篩選差異蛋白發(fā)現(xiàn)主要參與糖酵解與PPAR等通路。4)通過GC/MS檢測和多元統(tǒng)計分析,空白組與膽固醇組對比共有28個差異代謝物,其中有15個代謝物含量降低,如丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸、蛋氨酸等;13個代謝物含量升高,如乳酸糖、前列腺素E2等;酸+醇組與游離脂肪酸組對比共有17個差異代謝物,其中水楊酸膽甾烷-3,5,6-三醇代謝物含量降低;16個代謝物含量升高,如蘇氨酸、腺嘌呤、亞油酸甲酯、水楊酸、瓜氨酸等。這些差異代謝物主要參與糖異生與類固醇合成的代謝通路。結(jié)論:圍產(chǎn)期奶牛血液高膽固醇水平可降低產(chǎn)后低血鈣和能量負平衡相關(guān)疾病的發(fā)生;NEFA介導的肝細胞脂質(zhì)沉積實驗中,膽固醇通過上調(diào)3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)、己糖激酶(HK2)和山梨醇脫氫酶(SORD)來激活糖酵解途徑,減輕能量負平衡狀態(tài);膽固醇通過上調(diào)APOC3,下調(diào)FABPS,進而激活PPAR通路,促進VLDL合成加快TG清除,減少脂質(zhì)沉積。
【圖文】：

圖 2-1：標準曲線Figure 2-1: Standard curve曲線公式：y=0.7348x2+0.467x，，R2=0.9983公式計算各樣品蛋白濃度（見表 2-6）

膽固醇對能量負平衡奶牛肝脂代謝的影響21圖3-1 生物進程富集統(tǒng)計（P< 0.05）Figure 3-1 Biological process gene ontology statistics（P< 0.05）通過對細胞組分富集統(tǒng)計分析，差異蛋白顯著富集的有17個（P＜0.05），其中極顯著富集的有8個（P＜0.01），結(jié)果表明差異蛋白主要表達在細胞核、線粒體、線粒體內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上（見圖3-2）。圖3-2 細胞組分富集統(tǒng)計（P< 0.05）Figure 3-2 Cellular component gene ontology statistics（P< 0.05）通過對分子功能富集統(tǒng)計分析，差異蛋白顯著富集的有12個（P<0.05），其中極顯著富集的有5個（P<0.01），主要分子功能包括甘
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S823

【參考文獻】

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本文編號：2680603