【摘要】：豬腹瀉目前對我國養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,嚴重制約著我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,導(dǎo)致的豬腹瀉病原有許多,豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒是近年來發(fā)生腹瀉中最常見的。尤其這些病毒可以導(dǎo)致嚴重仔豬腹瀉,危害極大。本文根據(jù)GenBank中上傳序列,針對三種病毒保守基因PEDVN基因、TGEVN基因、PRoV VP7基因設(shè)計了三對特異性引物,建立了三重RT-PCR檢測方法,并對建立的RT-PCR檢測方法反應(yīng)體系和條件進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示建立的三重RT-PCR檢測方法具有良好的敏感性和特異性,能有效地應(yīng)用于三種病毒的流行病學調(diào)查。對應(yīng)用本實驗室已有兩株P(guān)EDV單克隆抗體mAb-PEDV-2C11和mAb-PEDV-lC12建立的膠體金快速檢測PEDV方法進行優(yōu)化,對膠體金試紙條的金標墊、樣品墊進行處理優(yōu)化,結(jié)合實驗室已有硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Filter Membrane)種類對NC膜進行選擇,對標記抗體濃度進行優(yōu)化。最終確定選用0.02 M PB(pH=8.5)、0.2%吐溫-20、1.5%BSA溶液對金標墊進行處理,0.8%的硼酸溶液對樣品墊進行處理,選擇使用1A/ANC膜作為最終NC膜使用,2 mg/mL的mAb-PEDV-lC12作為標記抗體,優(yōu)化后的檢測效果較優(yōu)化前靈敏度有了較大提升,比優(yōu)化前提升了8倍。初步建立PLA(Proximity Ligation Assay)檢測豬流行性腹瀉病毒方法,使用生物素B結(jié)合實驗室已有兩株P(guān)EDV單克隆抗體mAb-PEDV-1C12、mAb-PEDV-2Cll形成探針a(Probe a)和探針b(Probe b),由于單克隆抗體具有特異性從而與抗原結(jié)合,兩探針在小于40 nm范圍可以自發(fā)結(jié)合形成模板,用realtime PCR可以檢測到,可以直接用檢測到的陰性與陽性差值確定病料中病毒含量,從而省去對病料的RNA提取過程,大大縮短了檢測PEDV病毒所需時間。最終結(jié)果顯示建立的PLA檢測豬流行性腹瀉病毒方法能對陽性樣品和陰性對照進行有效區(qū)分。該方法還有待進一步優(yōu)化,以適應(yīng)臨床檢測的需要。對江蘇揚州、鹽城、連云港、常州、河南、廣西等地區(qū)養(yǎng)豬場進行糞便和腸道樣品收集,利用建立好的三重RT-PCR方法對收集到的982份病料進行檢測,結(jié)果顯示總PEDV陽性檢出率為9.1%(90/982),TGEV陽性檢出率為0.1%(1/982),PRoV陽性檢出率為0.2%(2/982)。其中江蘇鹽城若干家規(guī)模養(yǎng)殖場送檢的80份樣品檢測結(jié)果陽性率為26.2%(21/80),說明目前PED流行情況仍然存在且較為嚴重,同時在對鹽城采集的樣品檢測過程中發(fā)現(xiàn)1例PEDV、TGEV混合感染,2份PRoV陽性,說明豬場存在不同腹瀉病毒共感染情況。將陽性病料的PEDVORF3片段與NCBI上序列進行比較發(fā)現(xiàn),河南地區(qū)主要流行株與CV777、DR13等經(jīng)典株較接近,江蘇地區(qū)主要流行PEDV核苷酸序列與美國、泰國、韓國毒株接近,說明我國目前流行性腹瀉地區(qū)流行性差異較明顯。
【圖文】：

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【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

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