發(fā)布時間：2020-05-25 09:17

【摘要】：干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)是干擾素轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,是抗病毒感染天然免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子,主要參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng),誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生。為了研究IRF3和IRF7在表達(dá)調(diào)控中的作用,本研究檢測了IRF3和IRF7在犢牛組織中的分布情況,結(jié)果表明IRF3在犢牛脾臟中含量最高,在肝臟中含量最少,IRF7屬于誘導(dǎo)型表達(dá),在各個組織中的含量都很低。隨后對IRF3和IRF7進(jìn)行了克隆和表達(dá),并制備了高效價的多克隆抗體,為后續(xù)實驗提供了物質(zhì)材料。為了探索IRF3和IRF7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,本實驗以牛肝基因組為模板分別克隆了IRF3和IRF7啟動子,并分別構(gòu)建了IRF3和IRF7啟動子雙熒光素酶報告基因載體,利用雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)檢測IRF3和IRF7啟動子的活性,隨后構(gòu)建了包含IRF3和IRF7啟動子一系列5’側(cè)翼區(qū)不同長度截短片段的雙熒光素酶報告基因載體,結(jié)果表明IRF3基因上游-1511到-1012bp存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的正調(diào)控區(qū)域,-12至+40bp存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的負(fù)調(diào)控區(qū)域;IRF7基因上游-550到-311bp存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的正調(diào)控區(qū)域。生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)在IRF7基因上游-550到-311bp之間存在轉(zhuǎn)錄因子SP1和STAT1的結(jié)合位點。為了進(jìn)一步探索轉(zhuǎn)錄因子SP1和STAT1對IRF7的影響,本研究克隆了轉(zhuǎn)錄因子SP1和STAT1,并構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV-HA-SP1和pCMV-HA-STAT1,與IRF7啟動子共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,結(jié)果表明SP1和STAT1可增強IRF7啟動子的活性,過表達(dá)SP1和STAT1能增強IRF7的蛋白表達(dá)水平。隨后利用RNA干擾實驗,構(gòu)建了SP1和STAT1的干擾RNA pSH-SP1和pSH-STAT1,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染干擾RNA pSH-SP1和pSH-STAT1后可降低IRF7的啟動子活性,同時也會抑制IRF7的蛋白表達(dá)水平。本研究證明了IRF3基因上游的-1511到-1012bp存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的正調(diào)控區(qū)域,-12至+40bp存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的負(fù)調(diào)控區(qū)域;IRF7基因上游的-550到-311bp之間存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的正調(diào)控區(qū)域,轉(zhuǎn)錄因子SP1和STAT1在IRF7核心啟動子調(diào)控方面具有關(guān)鍵性的正調(diào)控作用。以上結(jié)果為IRF3和IRF7在天然免疫轉(zhuǎn)錄調(diào)控深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

言 真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)是指基因經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出來其儲存遺傳信息�；虮磉_(dá)是經(jīng)過多層次級別的過程，其各個階段經(jīng)過了從基因轉(zhuǎn)錄激活再到合成蛋白質(zhì)的過程。也就是說，基因表達(dá)包含以下四個方面：轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平及翻譯后水平的調(diào)控，基因表達(dá)調(diào)最為重要的是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[1]�；虻霓D(zhuǎn)錄水平調(diào)控需要順式調(diào)控元件和反式作用因子的和共同作用，才能達(dá)到對特定基因進(jìn)行調(diào)控的目的[2]。真核生物基本上由三部分組成：轉(zhuǎn)錄5’上游區(qū)和 3’下游區(qū)。5’上游區(qū)是轉(zhuǎn)錄起始點上游的 DNA 序列，包括啟動子區(qū)和增強區(qū)[1]子區(qū)臨近轉(zhuǎn)錄區(qū)，一般位于轉(zhuǎn)錄起點上游數(shù)百個堿基之內(nèi)；增強子區(qū)則可能位于遠(yuǎn)達(dá)幾千基的上游區(qū)域；3’下游區(qū)往往也是增強子區(qū)[1]。

進(jìn)行刺激 12h，，刺激結(jié)束后對樣品進(jìn)行收集，用 PBS 洗 3 遍，加入雙熒光素酶試劑盒中的細(xì)解液室溫裂解 15min，收集細(xì)胞裂解液。（3）IRF3啟動子雙熒光素酶活性的檢測用 Promega 的雙熒光素酶檢測試劑盒進(jìn)行雙熒光素酶的檢測，具體步驟按照說明書操作步行：首先分裝及配置 LARⅡ及 Stop & Glo Reagent，調(diào)試單管型發(fā)光檢測儀，取 10μL 的細(xì)解液樣品，加入到 50μL 的 LARⅡ檢測液中，點擊“Measure”鍵，讀取螢火蟲熒光素酶的數(shù)最后加入 50μL Stop & Glo Reagent終止液，讀取內(nèi)參對照海參熒光素酶的數(shù)值，螢火蟲熒酶的數(shù)值與海參熒光素酶的數(shù)值的比值即為啟動子雙熒光素酶的活性。利用 GraphPad 軟件數(shù)據(jù)，分析啟動子活性。.4 IRF3 基因啟動子核心功能區(qū)域鑒定4.1 IRF3 截短片段雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建（1）引物的設(shè)計及合成根據(jù)擴(kuò)增得到的 IRF3 啟動子序列為參考，擴(kuò)增特異性 IRF3 啟動子基因截短序列上下游引物F3 基因啟動子各缺失片段具體引物設(shè)計分別參照圖 2-1)。所用引物見表 2-5。表 2-1 中上游的酶切位點均為 Kpn I，下游為 Xho I，劃線處為酶切位點的位置。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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2 王俊陽;王為善;李肖;趙華;楊克遷;;轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的方法學(xué)進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報;2015年08期

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1 韋光輝;徐淮山羊Sox2、c-Myc和Oct4基因啟動子功能的初步研究[D];揚州大學(xué);2014年

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1 劉瑩;牛副流感病毒3型C和V蛋白通過負(fù)調(diào)控IRF7拮抗Ⅰ型干擾素表達(dá)的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 譚華菊;BVDV E2基因重組豬瘟病毒的構(gòu)建與豬IRF3/7克隆表達(dá)的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號：2679928