【摘要】：體細(xì)胞核移植技術(shù)盡管在許多哺乳動(dòng)物已獲得了成功,但克隆效率偏低仍然制約著該技術(shù)的應(yīng)用。供體細(xì)胞周期調(diào)控是提高核移植效率的重要途徑之一,因供體和受體細(xì)胞的細(xì)胞周期協(xié)調(diào)與克隆效率關(guān)系非常密切。Rapamycin是一種mTOR(mammalian target of rapamycin,mTOR)蛋白特異性抑制劑,能阻斷細(xì)胞由G1至S期的進(jìn)程,將細(xì)胞周期靜止在G1期。因此,本研究探討了Rapamycin和血清饑餓對BEF細(xì)胞周期和體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的影響,旨在尋找一種合適的供體細(xì)胞同期化方法,為提高水牛體細(xì)胞克隆效率提供理論和技術(shù)依據(jù)。首先,比較了不同濃度Rapamycin(0,0.5,1,2,4μM)處理對BEF細(xì)胞周期和活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),11μM Rapamycin處理組細(xì)胞的活力及G0/G1期的比例顯著高于對照組和其他試驗(yàn)組(P0.05)。比較Rapamycin處理BEF不同時(shí)間(0、48、72、96 h)對細(xì)胞周期的影響結(jié)果顯示:1μM Rapamycin處理BEF 72 h和96 h細(xì)胞G0/G1期比例顯著高于其他組(P0.05)。其次,比較了Rapamycin和血清饑餓法處理對BEF細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Rapamycin同期化效率顯著高于血清饑餓法(P0.05);qPCR結(jié)果顯示,Rapamycin和血清饑餓處理均能顯著下調(diào)CyclinD1、Cyclin基因的表達(dá)(P0.05),上調(diào)p27的表達(dá)水平(P0.05),但是Rapamycin組p27的表達(dá)水平顯著高于血清饑餓組(P0.05);而且Rapamycin還顯著下調(diào)了CDK2 的表達(dá)(P0.05);Western blot結(jié)果顯示,Rapamycin和血清饑餓都增加了p27蛋白的表達(dá)水平(P0.05),降低了CyclinDl蛋白表達(dá)(P0.05),但是Rapamycin也顯著抑制了mTOR蛋白的磷酸化水平(P0.05)。接著,探究了Rapamycin和血清饑餓法處理對BEF生理特征的影響。Annexin V-FITC雙染法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn):血清饑餓組凋亡水平顯著高于Rapamycin組(P0.05);qPCR結(jié)果顯示,Rapamycin顯著上調(diào)了抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)水平(P0.05),顯著下調(diào)了促凋亡基因Casepase3、Casepase9的表達(dá)(P0.05),而血清饑餓組顯著上調(diào)了促凋亡基因Bad的表達(dá)水平(P0.05);細(xì)胞活性氧檢測發(fā)現(xiàn),與Rapamycin處理組相比,血清饑餓處理顯著增加了細(xì)胞ROS水平(P0.05);對BEF細(xì)胞代謝相關(guān)基因表達(dá)的檢測發(fā)現(xiàn),Rapamycin處理組顯著上調(diào)了代謝相關(guān)基因ACADVL、Ass、HMGCL的表達(dá)水平(P0.05)。此外,BEF經(jīng)Rapamycin處理后細(xì)胞具有正常染色體倍數(shù)的細(xì)胞比例顯著高于血清饑餓組(P0.05)。最后,比較了Rapamycin和血清饑餓處理BEF對其核移植后胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BEF經(jīng)Rapamycin處理用作供體細(xì)胞進(jìn)行核移植,核移植胚胎的8細(xì)胞率和囊胚率顯著高于血清饑餓組和對照組(P0.05)。以上結(jié)果表明,(1)適宜濃度(1μM)的Rapamycin處理水牛耳部成纖維細(xì)胞一定時(shí)間(72 h)能夠提高細(xì)胞活力和G0/G1期的比例。(2)Rapamycin處理水牛耳部成纖維細(xì)胞后G0/G1期的比例顯著高于血清饑餓法,這一作用可能是因?yàn)镽apamycin通過抑制mTOR磷酸化水平影響了細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)所致。(3)Rapamycin處理水牛耳部成纖維細(xì)胞后凋亡水平顯著低于血清饑餓組,推測可能和Rapamycin降低細(xì)胞ROS水平、調(diào)控體內(nèi)代謝有關(guān)。(4)Rapamycin顯著提高了核移植胚胎發(fā)育能力,這一作用可能與Rapamycin提高BEF G0/G1期比例和細(xì)胞活力有關(guān)。
【圖文】：

分別使用不同濃度的Ｒａｐａｍｙｃｉｎ邋（０，邋０．５，邋１，邋２，邋４邋ｈＭ）處理ＢＥＦ邋３ｄ并使用ＣＣＫ－８逡逑對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，0．５｜ｉＭ，ｌｐｉＭ，２ｊ＿ｉＭ，４ｐＭ濃度的Ｒａｐａｍｙｃｉｎ處理組為試驗(yàn)組，０逡逑ｐＭ處理組為對照組。結(jié)果如圖１－１所示，在ＢＥＦ培養(yǎng)過程中添加Ｒａｐａｍｙｃｉｎ能夠提高細(xì)逡逑胞的活力水平，并且細(xì)胞活力隨著處理濃度的增加呈現(xiàn)先升高而后降低的趨勢，其中ＵｉＭ逡逑和２邋｜＿ｉＭ的Ｒａｐａｍｙｃｉｎ處理細(xì)胞時(shí)細(xì)胞活力最高，顯著高于對照組和其他試驗(yàn)組（尸＜邋０．０５）。逡逑３１逡逑

本試驗(yàn)以Ｒａｐａｍｙｃｉｎ處理法（１０％ＦＢＳ＋１Ｒ）和血清饑餓法（０．５％ＦＢＳ）分別處理ＢＥＦ逡逑３ｄ為試驗(yàn)組，以標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（Ｉ０％ＦＢＳ）培養(yǎng)ＢＥＦ邋３ｄ作為對照組，，收集各組細(xì)胞，進(jìn)行逡逑細(xì)胞核型分析，選取染色清晰的染色體進(jìn)行拍照（如圖１－１０）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表１－１２逡逑所示，Ｒａｐａｍｙｃｉｎ組細(xì)胞具有正常染色體倍數(shù)的細(xì)胞比例顯著高于血清饑餓組（Ｐ邋＜邋０．０５邋）。逡逑表１－１２邋Ｒａｐａｍｙｃｉｎ對ＢＥＦ細(xì)胞核型的影響逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１２邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｒａｐａｍｙｃｉｎ邋ｏｎ邋ＢＥＦ邋ｃｅｌｌ邋Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ逡逑ＢＥＦ邐整二倍體個(gè)數(shù)（２ｎ）邐非整二倍體個(gè)數(shù)（＃２ｎ）￣整二倍體細(xì)胞比率（％）逡逑Ｄｉｐｌｏｉｄ邋ｎｕｍｂｅｒ邋Ｎｏｎ－ｄｉｐｌｏｉｄ邋ｎｕｍｂｅｒ邐Ｎｏｒｍａｌ邋ｒａｔｅ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐３５邐１２邐７４．４７邋土邋０．７７ａ逡逑Ｒａｐａｍｙｃｉｎ邐３２邐１０邐７６．１９邋±０．４３ａ逡逑Ｓｅｒｕｍ邋ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ邐３０邐１６邐６５．２２邋土邋０．１２ｂ逡逑注：Ｍ列同字付丨？．標(biāo)的饑代農(nóng)范異Ｖp海ǎ校跡埃埃擔(dān)╁義希危錚簦澹哄澹模椋媯裕澹潁澹睿翦澹歟澹簦簦澹潁簀澹椋鑠澹簦瑁邋澹螅幔恚邋澹悖錚歟酰恚鑠澹椋睿洌椋悖幔簦邋澹螅椋紓睿椋媯椋悖幔睿翦澹洌椋媯媯澹潁澹睿悖澹螅澹椋繡澹煎澹埃埃靛澹╁義希常瑰義

本文編號：2679677