【摘要】：豬瘟(classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起豬的一種急性、烈性傳染病。其病原CSFV,為黃病毒科瘟病毒屬成員,是具有囊膜的單股、正鏈RNA病毒。CSFV具有高、中、低毒力毒株,不同毒力的毒株感染宿主后能夠引起不同的臨床癥狀及宿主反應(yīng)。前期雖然有研究利用微陣列技術(shù)對CSFV感染的細(xì)胞進(jìn)行分析,并將差異轉(zhuǎn)錄的基因分類,但是并未解析差異基因影響病毒復(fù)制的機(jī)制。因此,篩選CSFV強(qiáng)弱毒株誘導(dǎo)的差異轉(zhuǎn)錄宿主分子,鑒定其對CSFV復(fù)制的影響并闡明其發(fā)揮作用的分子機(jī)制,將為深入揭示CSFV的致病機(jī)制和宿主的抗病毒反應(yīng)提供線索。本研究中,我們將11頭8周齡SPF豬隨機(jī)分為3組,分別經(jīng)頸部肌肉注射10~4.5.5 TCID_(50)的CSFV強(qiáng)毒株(石門株)和弱毒株(C株),并以注射等體積的DMEM組作為陰性對照。在感染前、感染后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行體溫監(jiān)測、臨床評分、血液中病毒載量檢測、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子檢測等試驗(yàn),以此構(gòu)建CSFV強(qiáng)弱毒株感染的SPF豬模型,并對CSFV強(qiáng)弱毒株引起豬只的宿主反應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)地分析。CSFV石門株感染豬出現(xiàn)發(fā)熱、臨床癥狀及組織學(xué)病理學(xué)損傷等;C株接種后雖然豬只的血液和組織器官中都能夠檢測到低水平的病毒基因組,但是并未觀察到任何臨床癥狀和組織病理學(xué)變化,結(jié)果說明CSFV強(qiáng)弱毒株影響CSF的病程和強(qiáng)度,而不影響病毒的組織嗜性和分布。此外,CSFV強(qiáng)弱毒株感染誘導(dǎo)不同程度的淋巴細(xì)胞的凋亡、T淋巴細(xì)胞亞群分化以及血清中白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6和IL-10的變化。由此表明,CSFV強(qiáng)弱毒株引起宿主不同程度的免疫反應(yīng)從而導(dǎo)致疾病不同的發(fā)生、發(fā)展和結(jié)局。進(jìn)一步分離CSFV強(qiáng)弱毒株感染豬只的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,以篩選差異轉(zhuǎn)錄的宿主分子。結(jié)果顯示:在病毒感染后3 d,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生2倍以上變化的基因共3,582個(gè),其中上調(diào)的基因有3,205個(gè),而下調(diào)的基因有377個(gè);在病毒感染后5 d,轉(zhuǎn)錄水平變化2倍以上的基因共7,456個(gè),其中上調(diào)的基因有83個(gè),而下調(diào)的基因有7,373個(gè);在顯著富集的前30個(gè)信號通路中,與免疫和病毒感染相關(guān)的信號通路包括NF-κB、RIG-I樣受體、Toll樣受體和JAK-STAT信號通路。結(jié)合生物信息學(xué)分析,我們選擇20個(gè)候選分子進(jìn)行RNAi試驗(yàn),驗(yàn)證這些宿主因子對CSFV石門株復(fù)制的影響,發(fā)現(xiàn)IL-10、VLDLR和USP18下調(diào)后能夠顯著抑制CSFV石門株的復(fù)制,而HES4(Hairy and enhancer of split4)、Stefin A1、CYSLTR2、LGASL1、IFIT1、ISG15、CASP1、MOV10、USP25、Trim5、DDX58和ISG20下調(diào)后能夠明顯促進(jìn)CSFV的復(fù)制。宿主分子HES4屬于堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)超家族中的轉(zhuǎn)錄抑制因子,該分子在強(qiáng)毒石門株感染組中上調(diào)表達(dá),而在弱毒C株感染組中無明顯變化,我們選擇該分子進(jìn)行深入研究。研究發(fā)現(xiàn),與C株接種組不同的是,石門株感染豬只后能夠促進(jìn)各組織、器官和PBMCs中HES4的上調(diào)。在體外試驗(yàn)中,感染CSFV石門株后,同樣能夠上調(diào)表達(dá)豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中HES4的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步證明HES4在CSFV石門株感染過程中發(fā)揮的作用,我們利用慢病毒系統(tǒng)建立了穩(wěn)定表達(dá)HES4的PAM細(xì)胞系,感染CSFV石門株,結(jié)果顯示,過表達(dá)HES4顯著抑制CSFV的復(fù)制;而利用特異的siRNA下調(diào)HES4蛋白的表達(dá)后能夠顯著促進(jìn)病毒的復(fù)制,表明HES4能夠負(fù)調(diào)控CSFV的感染。在HES4抗病毒機(jī)制方面,我們研究表明,過表達(dá)HES4不影響IFN-β和NF-κB信號通路的活化,而能夠呈現(xiàn)劑量依賴性地抑制CSFV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)介導(dǎo)的蛋白翻譯效率。此外,我們利用生物素標(biāo)記的IRES進(jìn)行RNA pulldown試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HES4能夠與IRES結(jié)合;應(yīng)用游離的IRES進(jìn)行競爭性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其可有效地抑制這種結(jié)合,從而表明HES4與IRES的相互作用是特異性的。綜上所述,HES4是CSFV強(qiáng)弱毒株誘導(dǎo)的差異轉(zhuǎn)錄宿主分子,該分子與CSFV IRES相互作用并抑制其活性以拮抗CSFV的復(fù)制。
【圖文】：

圖1.1 我國CSFV基因型分布（引自Luo et al., 2014）。Fig. 1.1 Distribution of CSFV genotypes in China (From Luo et al., 2014).豬瘟病毒FV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（PPletnev et al., 2011）。病毒形態(tài)呈圓形、有囊膜、直徑約為40-60 nm，衣殼呈二有病毒單股正鏈RNA基因組。CSFV的基因組由5 非編碼區(qū)（5 -noncoding region的開放閱讀框（open reading frame, ORF）和3 -NCR組成。ORF編碼一個(gè)大小為多聚蛋白，并且在病毒和宿主蛋白酶的作用下被切割成4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）（Lindenbach 2）。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言4圖1.1 我國CSFV基因型分布（引自Luo et al., 2014）。Fig. 1.1 Distribution of CSFV genotypes in China (From Luo et al., 2014).1.1.2 豬瘟病毒CSFV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）成員（Pletnev et al., 2011）。病毒形態(tài)呈圓形、有囊膜、直徑約為40-60 nm，，衣殼呈二十面體對稱，內(nèi)含有病毒單股正鏈RNA基因組。CSFV的基因組由5 非編碼區(qū)（5 -noncoding region, 5 -NCR）、一個(gè)大的開放閱讀框（open reading frame, ORF）和3 -NCR組成。ORF編碼一個(gè)大小為3,898個(gè)氨基酸的多聚蛋白，并且在病毒和宿主蛋白酶的作用下被切割成4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、E1和E2）和8種非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）（Lindenbach et al., 2013）（圖1.2）。圖1.2 CSFV基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白模式圖（引自Li et al., 2017）。Fig. 1.2 Organization of the CSFV genome and polyprotein processing (From Li et al., 2017)
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

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本文編號：2679410