【摘要】：狂犬病病毒(RABV)是具神經(jīng)嗜性的高度致死性人獸共患傳染性病原,感染機體可引起神經(jīng)性腦脊髓炎,臨床表現(xiàn)出恐水、怕風、肌肉痙攣等癥狀,死亡率高達100%。RABV病毒粒子由5種結(jié)構(gòu)蛋白組成,分別為核蛋白(N)、磷蛋白(P)、糖蛋白(G)、基質(zhì)蛋白(M)和依賴RNA的RNA多聚酶(L);其中N、P、L組成核糖核蛋白復(fù)合體(RNP),在RABV復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程中起著非常關(guān)鍵的作用;G負責識別細胞膜上受體并介導(dǎo)病毒的胞內(nèi)運輸過程,在RABV入胞過程中的作用十分重要。細胞內(nèi)吞是通過細胞質(zhì)膜的變形運動將細胞外物質(zhì)轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)的過程。不僅蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)借用此過程進入細胞,許多有囊膜病毒也通過內(nèi)吞方式進入細胞,實現(xiàn)其對宿主的感染。網(wǎng)格蛋白是最為常見的一種內(nèi)吞標志蛋白,其介導(dǎo)多數(shù)大分子物質(zhì)的入胞過程;小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑在物質(zhì)入胞過程中同樣起重要作用,其中小窩蛋白1是小窩的標志性蛋白,而膽固醇在維持小窩的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性作用中十分關(guān)鍵,因此細胞中小窩蛋白1表達量和膽固醇含量是衡量小窩功能的一個重要標志。本研究首先利用蛋白酶k處理的方法,選取接毒孵育的不同時間點加入蛋白酶k并收集細胞,確定RABV感染N2a細胞的入胞時間;隨后以網(wǎng)格蛋白和小窩依賴性內(nèi)吞方式為出發(fā)點,在N2a細胞中,加入網(wǎng)格蛋白特異性抑制劑氯丙嗪、膽固醇抽提劑制霉菌素和甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)、發(fā)動蛋白特異性抑制劑dynasore和囊泡酸化特異性抑制劑巴佛洛霉素a1處理細胞后感染RABV。采用RT-q PCR及western blot方法檢測RABV N的表達量;通過免疫熒光方法觀察藥物處理后RABV在N2a細胞中的感染率;隨后采用基因沉默手段下調(diào)N2a細胞中網(wǎng)格蛋白重鏈及小窩蛋白1的表達水平,并采用RT-q PCR和western blot方法檢測RABV N基因拷貝數(shù)和N蛋白表達水平。為驗證RABV在不同細胞系中的入胞途徑,本研究還在SH-SY5Y和Vero細胞中加入上述抑制劑后感染RABV,采用RT-q PCR方法檢測RABV N基因拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,在2h時大約95%病毒粒子進入細胞。隨后觀察到,經(jīng)氯丙嗪、dynasore、巴佛洛霉素a1處理的N2a細胞感染RABV后,隨藥物濃度增大,與對照組相比,細胞中RABV N基因拷貝數(shù)及N蛋白的表達水平均呈劑量依賴性下降趨勢;免疫熒光檢測結(jié)果顯示,藥物處理后,N蛋白熒光數(shù)量與對照組相比顯著減少。然而制霉菌素和MβCD處理N2a細胞后,細胞中RABV N基因拷貝數(shù)和N蛋白表達量與對照組相比無顯著差異。隨后下調(diào)網(wǎng)格蛋白重鏈的表達后,RABV N基因拷貝數(shù)和N蛋白表達水平與對照組相比均顯著降低,而下調(diào)小窩蛋白1的表達后,RABV N基因拷貝數(shù)和N蛋白表達量與對照組相比均無顯著差異。在SH-SY5Y和Vero細胞中加入氯丙嗪、dynasore、巴佛洛霉素a1后RABV N基因拷貝數(shù)與對照組相比也顯著下降,而加入制霉菌素后RABV N基因拷貝數(shù)與對照組相比無顯著差異,此結(jié)果與N2a細胞中的檢測結(jié)果一致。以上結(jié)果表明,RABV需要約2小時完成對N2a細胞的感染。且RABV進入N2a細胞不依賴于小窩內(nèi)吞途徑,而依賴于網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)、發(fā)動蛋白剪切作用和內(nèi)吞體的酸化作用,而在SY5Y和Vero細胞中初步驗證結(jié)果與N2a細胞中一致,表明RABV進入不同細胞系的入胞途徑可能相一致。本研究結(jié)果為進一步研究狂犬病病毒感染不同細胞系的相應(yīng)機制和針對RABV入胞的藥物靶點研究提供了新的數(shù)據(jù)。
【圖文】：

第一篇 文獻綜述 第二章 病毒入胞機制研究進展泡與胞膜脫離機制的體外研究已十分清晰，但其在體內(nèi)發(fā)揮作用是如何被調(diào)控以及它在體內(nèi)真正的作用機理目前仍然沒有明確結(jié)論[50-52]，仍有待進一步研究。多數(shù)病毒利用一種或多種細胞內(nèi)吞途徑進入細胞，病毒通過內(nèi)吞作用進入細胞可以使其逃避細胞膜對外來入侵物質(zhì)的阻隔作用而順利到達細胞質(zhì)中。大多數(shù)依賴內(nèi)吞入胞的病毒利用了上百種胞質(zhì)蛋白進入細胞，隨后由膜泡運輸系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至各個細胞器。如圖 2.1[4]所示，病毒可以利用多種內(nèi)吞機制來促使自身進入細胞，其中網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式被多數(shù)病毒所利用。

2.2 小窩蛋白介導(dǎo)的病毒內(nèi)吞機制由小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞方式的一個典型標志，是早期內(nèi)吞體的形成依賴于膽固醇、脂筏和一系列包含酪氨酸激酶、磷酸酶的復(fù)雜信號通路[64]，，此過程由配體觸發(fā)，是細胞內(nèi)吞途徑中的一個重要過程。組成小窩的小窩相關(guān)蛋白在細胞內(nèi)組成復(fù)合體，它們在體外可以進行相互作用并與細胞進行免疫共沉淀反應(yīng)[65, 66]；利用蔗糖密度梯度離心的方法可以將組成小窩蛋白復(fù)合體的相關(guān)蛋白彼此分離[67]，最近 LudwigA 等[68]研究發(fā)現(xiàn)，Hela 細胞中表達的組成小窩的相關(guān)蛋白通過分離可以得到一個 80S 復(fù)合體，如圖 2.2 所示，此復(fù)合體的分子組成可以表示為12 個 caveolin：3 個 cavin 1：1 個 cavin 2 或 cavin 3。其中 cavin 1 參與核糖體RNA 的合成過程，并且在細胞核內(nèi)參與基因的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程[69]；而小窩蛋白1（caveolin-1）則在細菌中可以獨立完成細胞膜囊泡的形成[70]，參與許多重要生理過程。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 盧小東,覃文新,楊勝利;V-ATPase:結(jié)構(gòu)、功能及其在腫瘤細胞中的作用[J];生命科學;2004年02期

2 姚鵬程,葉恭銀;網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用機制[J];生命科學研究;2003年S1期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 楊玉姣;狂犬病病毒靶向RNA干擾制劑的研制與鑒定研究[D];吉林大學;2013年

本文編號：2678585