【摘要】：肝臟在維持機(jī)體糖脂代謝平衡中扮演著重要角色。本研究室前期在細(xì)胞水平的研究表明,葡萄糖和果糖誘導(dǎo)鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的能力不同,提示不同類型糖誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積能力不同。CPT1A、MTP是脂質(zhì)代謝中脂肪酸氧化和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑上起關(guān)鍵作用的基因。本研究以天府肉鵝母系為研究對(duì)象,克隆鵝CPT1A、MTP基因的CDS區(qū)序列,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析;采用半原位二步膠原酶灌注法分離培養(yǎng)鵝原代肝細(xì)胞,通過葡萄糖、果糖和蔗糖分別處理體外培養(yǎng)的鵝原代肝細(xì)胞并分別轉(zhuǎn)染CPT1A、MTP干擾質(zhì)粒,采用MTT檢測細(xì)胞活力,熒光定量PCR法、Elisa試劑盒檢測法以及油紅O染色法檢測脂肪酸合成,VLDL-TG分泌轉(zhuǎn)運(yùn)以及脂肪酸合成、脂肪酸氧化和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的相關(guān)指標(biāo)來反映脂質(zhì)代謝的變化,初步探討CPT1A、MTP干擾對(duì)三種糖誘導(dǎo)的鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響,能夠更為清晰的了解糖誘導(dǎo)肝脂質(zhì)沉積的機(jī)理。主要結(jié)果如下:1.通過設(shè)計(jì)分段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并拼接獲得鵝CPT1A、MTP基因CDS區(qū)序列。鵝CPT1A、MTP基因的CDS區(qū)序列分別編碼770、893個(gè)氨基酸。2.分別轉(zhuǎn)染CPT1A、MTP干擾質(zhì)粒24小時(shí)后,Q-PCR檢測顯示CPT1A、MTP干擾效率分別達(dá)51.3%、62.6%,表明CPT1A、MTP干擾鵝肝細(xì)胞成功。3.轉(zhuǎn)染CPT1A干擾質(zhì)粒后,FAS、ACCαmRNA表達(dá)量無顯著變化,SREBP1mRNA表達(dá)量顯著下降(P0.05),FAS、ACCα激酶含量顯著升高(P0.05);CPT1A、ACOX1、PPARαmRNA表達(dá)量顯著下降(P0.05),CPT1A激酶含量顯著降低(P0.05);MTP、APOB、DGAT1 mRNA表達(dá)量顯著下降(P0.05),MTP、APOB激酶含量無顯著變化。油紅O染色顯示鵝肝細(xì)胞干擾CPT1A使細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒增多,脂質(zhì)沉積明顯,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)外TG含量增加,而胞外VLDL含量減少。4.轉(zhuǎn)染MTP干擾質(zhì)粒后,FAS、ACCαmRNA表達(dá)量顯著升高(P0.05),SREBP1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.05),FAS、ACCα激酶含量顯著升高(P0.05);CPT1A、ACOX1、PPARαmRNA表達(dá)量無顯著變化,CPT1A激酶含量無顯著變化;MTP、APOB mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.05),DGAT1 mRNA表達(dá)量無顯著變化,MTP激酶含量顯著降低(P0.05),APOB激酶含量無顯著變化。油紅O染色顯示鵝原代肝細(xì)胞干擾MTP后,細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒增多,脂質(zhì)沉積明顯,同時(shí)胞內(nèi)外TG和胞內(nèi)VLDL含量增加,而胞外VLDL含量減少。5.與單獨(dú)葡萄糖或單獨(dú)蔗糖處理相比,葡萄糖或蔗糖處理同時(shí)干擾CPT1A后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表達(dá)量及FAS、ACCα蛋白激酶含量升高,CPT1A、ACOX1基因表達(dá)量降低,MTP、APOB基因表達(dá)量及MTP蛋白激酶含量降低。與單獨(dú)果糖處理相比,果糖處理同時(shí)干擾CPT1A后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表達(dá)量及FAS、ACCα蛋白激酶含量降低,CPT1A、ACOX1基因表達(dá)量降低,MTP、APOB基因表達(dá)量及MTP蛋白激酶含量降低。油紅O染色顯示三種糖分別處理同時(shí)干擾CPT1A使細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒增多,脂質(zhì)沉積明顯,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)TG和胞內(nèi)VLDL含量增加。6.與單獨(dú)葡萄糖或蔗糖處理相比,葡萄糖或蔗糖處理同時(shí)干擾MTP后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表達(dá)量及FAS、ACCα蛋白激酶含量升高,脂肪酸氧化途徑上的重要基因表達(dá)量及其蛋白激酶含量無顯著變化,MTP、APOB基因表達(dá)量及MTP蛋白激酶含量降低。與單獨(dú)果糖處理相比,果糖處理同時(shí)干擾MTP后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表達(dá)量及FAS、ACCα蛋白激酶含量降低,CPT1A、ACOX1基因表達(dá)量升高,MTP、APOB基因表達(dá)量及MTP蛋白激酶含量降低。油紅O染色顯示分別三種糖處理同時(shí)干擾MTP使細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒增多,脂質(zhì)沉積明顯,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)外TG和胞內(nèi)VLDL含量增加。
【圖文】：

2.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析利用 SPSS 12.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，，數(shù)據(jù)處理軟件為 Excel 、SPSS 22 、GraphPad 7，采用 T-test 進(jìn)行樣本資料兩組間顯著性分分析，多組之間比較采用方差分析，利用 Tukey、鄧肯法多重比較的顯著性分析，用來分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)意義，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means± SE），形式表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)上， P < 0.05 代表差異顯著。3 試驗(yàn)結(jié)果3.1 鵝 CPT1A、MTP 基因 CDS 區(qū)的拼接與鑒定采用普通 PC 的方法獲得條帶單一、明亮的目的片段，經(jīng)測序?yàn)橄鄳?yīng)分段引物所得產(chǎn)物。采用 DNAStar 對(duì)分段產(chǎn)物序列結(jié)果進(jìn)行拼接，如圖 1 所示得到了鵝 CPT1A、MTP 基因的 CDS 區(qū)序列分別為 2313bp、2682bp。拼接序列包含部分 CPT1A5’UTR(131bp)和 3’UTR(146bp)，MTP 5’UTR(153bp)和 3’UTR(56bp)。

圖 2 鵝 CPT1ACDS 區(qū)序列拼接Fig.2 Coding sequenee assembly of goose MTP3.2 鵝 CPT1A、MTP 基因 miRNA 干擾載體構(gòu)建及篩選3.2.1 干擾載體構(gòu)建由北京百奧邁科生物科技有限公司構(gòu)建鵝 CPT1A、MTP 基因干擾載體，選擇了針對(duì)鵝 CPT1A、MTP 基因特異性的位點(diǎn)，每個(gè)基因設(shè)計(jì)了 3 條相應(yīng)寡核苷酸序列，經(jīng) BLAST 檢索不與鵝的其他任何基因存在同源序列。3.2.2 最佳干擾序列的篩選為篩選最佳干擾序列，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將這 6 條干擾載體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞24h，用熒光定量檢測 CPTlA、MTP 的 mRNA 表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CPTlA 基因第條干擾載體可抑制 CPTlA 的表達(dá)，干擾效率達(dá) 51.3%；MTP 基第 2 條干擾載體可抑
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S835

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本文編號(hào)：2678145