【摘要】：目的本研究共兩部分,第一部分:從免疫學(xué)、分子生物學(xué)、病理學(xué)等方面對(duì)大理豬弓形蟲Toxo DB#9型蟲株的毒力進(jìn)行研究,探究ToxoDB#9型弓形蟲速殖子的毒力特點(diǎn),從而為深入研究弓形蟲感染宿主的致病機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);第二部分:調(diào)查墨江縣少數(shù)民族地區(qū)新生兒弓形蟲感染情況并分析其危險(xiǎn)因素,為本地區(qū)優(yōu)生優(yōu)育工作的開展提供科學(xué)依據(jù)。方法本研究第一部分(云南大理豬弓形蟲蟲株毒力研究)大理豬ToxoDB#9型弓形蟲速殖子由實(shí)驗(yàn)室保存。6-8周齡健康清潔級(jí)昆明小鼠共200只,隨機(jī)分為10組(8個(gè)ToxoDB#9型弓形蟲感染組,1個(gè)空白組和1個(gè)RH株組),每組20只,雌雄各半。腹腔注射方式感染接種,其中8個(gè)ToxoDB#9型弓形蟲感染組接種劑量為:10~0、10~1、10~2、10~3、10~4、10~5、10~6、10~7個(gè);RH標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)照組接種10~3個(gè)、空白組注射生理鹽水,各組分籠飼養(yǎng),同一環(huán)境采食飲水。感染處理后每天觀察小鼠飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)和發(fā)病情況,隔天稱小鼠體重,記錄體重變化,記錄小鼠死亡時(shí)間;在感染后第5天、10天、20天、30天、45天,每組隨機(jī)取雌雄小鼠各1只,摘眼球取血,離心取上清液,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠血清弓形蟲IgG抗體,并取脾臟組織PCR檢測(cè)擴(kuò)增弓形蟲特性B1基因,以確定小鼠獲得感染和死亡,從而統(tǒng)計(jì)各組小鼠的感染率和死亡率。將ToxoDB#9型10~2、10~4、10~6感染組分別定義為低、中、高劑量組,感染后第3天、7天、15天、45天,隨機(jī)從低、中、高劑量組與空白對(duì)照組、RH株組中抽取雌雄小鼠各1只,摘眼球取血,分離上清,ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ,無菌條件下取出各組織浸泡于福爾馬林固定液,第二天常規(guī)石蠟切片進(jìn)行HE染色,檢查病理變化。第二部分:(云南墨江縣新生兒弓形蟲血清流行病學(xué)調(diào)查)原始數(shù)據(jù)資料來源于2016年10月至2017年4月在墨江縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科接生的311例新生兒與對(duì)應(yīng)產(chǎn)婦的血清,用ELISA法檢測(cè)血清中弓形蟲IgG抗體,并用X~2檢驗(yàn)法結(jié)合分析不同民族、胎兒性別、孕婦年齡、妊娠史等因素和弓形蟲血清抗體陽性率的差異性。結(jié)果1.1在第一部分研究中,腹腔注射感染后24h,RH株組小鼠精神萎靡,活動(dòng)量略下降;"g10~5 ToxoDB#9型劑量組小鼠精神狀況略微下降,活動(dòng)量略減少,飲食飲水正常;"f10~4劑量組與空白組小鼠采食、飲水、活動(dòng)均正常。感染后48h,RH株組小鼠精神狀況不佳,采食飲水量減少,有1只小鼠眼結(jié)膜出現(xiàn)紅腫;"g10~3 ToxoDB#9型劑量組小鼠精神狀況略微下降,喜臥,背略弓,飲食飲水正常;"f10~2劑量組與空白組小鼠采食、飲水、活動(dòng)均正常。感染后72h,"g10~3劑量組與RH株組小鼠均出現(xiàn)精神沉郁、喜臥,采食飲水量明顯減少,被毛逆立,背略弓的癥狀,10~6劑量組2只小鼠腹部膨隆癥狀,10~5、10~6、10~7劑量組均有2只小鼠眼結(jié)膜出現(xiàn)紅腫;"f10~2劑量組與空白組小鼠未見異常。15日后各感染組急性期耐過后,存活小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)量、飲食飲水趨近正常;ToxoDB#9型蟲株10~5、10~6、10~7劑量組各有2、4、3只小鼠四肢、頸部部位出現(xiàn)腫塊;"f10~4劑量組與空白組小鼠正常生長(zhǎng),未見異常情況。1.2 10~0、10~1及≥10~2劑量組中的弓形蟲感染率分別為10%(2/20)、40%(8/20)及100%(20/20)。10~0、10~1劑量組與空白組小鼠未出現(xiàn)死亡;≥10~2劑量組皆可引起實(shí)驗(yàn)小鼠死亡。1.3 ELISA檢測(cè)血清IgG抗體,結(jié)果顯示:感染后第3天,感染組、RH株組、空白組小鼠血清IgG抗體均為陰性;感染后第5天,ToxoDB#910~6劑量組小鼠血清IgG抗體陽性,RH株組、空白組與其他各感染組均為陰性;感染后第10天,10~5、10~6、10~7劑量組和RH株組為陽性,其余各組檢測(cè)結(jié)果為陰性;感染第后20天、30天、45天,除10~0劑量組和空白組之外,其余組小鼠血清IgG抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽性。1.4 PCR檢測(cè)脾臟組織弓形蟲特性B1基因,結(jié)果顯示:感染后第5天,RH組、"g10~4劑量組小鼠PCR陽性,而空白組與"f10~3劑量組為陰性;感染后第10天,"g10~3劑量組與RH株組檢測(cè)結(jié)果為陽性,其余各組檢測(cè)結(jié)果為陰性;感染后第20天,空白組和10~o、10~1劑量組檢測(cè)結(jié)果為陰性,RH株組與其余各劑量組檢測(cè)結(jié)果為陽性;感染后第30天、45天除10~0劑量組和空白組之外,其余感染組均為陽性。1.5血清細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示:各感染組小鼠血清IFN-γ高于空白組、呈現(xiàn)劑量增加數(shù)值升高的趨勢(shì),于感染后7天達(dá)到最高,之后下降,至感染初期水平。低劑量組于感染后第15天后逐步上升。低劑量組、中劑量組、與空白對(duì)照組、RH組波動(dòng)范圍較小,高劑量組波動(dòng)范圍較大;高劑量組小鼠血清IL-2水平明顯高于其它組,并于感染后第7天達(dá)到最高,之后略下降,而后又上升。而低劑量組、中劑量組、與空白對(duì)照組、RH株組的IL-2水平波動(dòng)范圍較小;中劑量、高劑量、RH株組小鼠血清IL-12水平高于空白組和低劑量組,中劑量組RH株對(duì)照組于感染后7天達(dá)到最高,高劑量組則于感染后15天達(dá)到峰值。1.6感染組小鼠剖檢肉眼觀察結(jié)合病理切片發(fā)現(xiàn),10~5、10~6、10~7劑量組小鼠臟器組織均有不同程度的損傷,其中10~6劑量組最大為典型:脾腫大、淤血;腎腫大;肝腫大、淤血,肝臟變性、壞死;肺腫脹實(shí)變,肺炎;肺與腎臟病理切片鏡檢可見,肺泡間增寬、腎小管上皮脫落壞死。2在第二部分研究中,墨江縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科接生的311份胎兒臍血血清弓形蟲IgG抗體總陽性率為17.36%(54/311),其中哈尼族、漢族、彝族、拉祜族、其他少數(shù)民族弓形蟲IgG抗體陽性率分別為17.01%(33/194),18.05%(13/72),15.00%(3/20),25.00%(2/8),17.65%(3/17)。不同民族、新生兒性別、孕婦年齡、妊娠史之間弓形蟲IgG抗體血清陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.與RH株相比,大理豬ToxoDB#9型弓形蟲蟲株感染昆明小鼠毒力弱于RH株。2.云南墨江縣新生兒弓形蟲IgG抗體總陽性率為17.4%。
【圖文】：

圖 1.1VERO 株細(xì)胞生長(zhǎng)情況Figure 1.1 VERO cell growth體外細(xì)胞培養(yǎng)速殖子及純化1）打開液氮罐，立即拿出凍存的弓形蟲 ToxoDB#9 蟲株和 RH 蟲株，在徹底融化后（約 2-3 min），將其轉(zhuǎn)移至無菌操作臺(tái)操作，無菌操作使用移，移至高壓滅菌 10ml 試管中（預(yù)先加入 2-3ml10%細(xì)胞維持培養(yǎng)基），35min，棄上清液，后接種到培養(yǎng)好的 vero 細(xì)胞中，置 37℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱更換一次維持培養(yǎng)基。2）待蟲株布滿培養(yǎng)瓶后，將蟲株與細(xì)胞刮入培養(yǎng)基，開始以 20 號(hào)過濾針次，繼而以27號(hào)針頭重復(fù)破裂3 次，采集蟲體懸液，室溫3500 rpm /min 離心液。用適量 PBS 水漂洗沉淀，再用 10ml10%不含雙抗培養(yǎng)液重懸，此過收集并計(jì)數(shù)使用。

圖 1.2 弓形蟲速殖子在 VERO 株細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)情況Figure1.2 Growth of T. gondii tachyzoites in VERO strain cells鮑爾計(jì)數(shù)板上加蓋玻片，以微量移液器抽吸 10μl 混勻的速殖子入改良紐鮑爾計(jì)數(shù)板與蓋玻片間的間隙，靜置 2 min，光學(xué)顯微角的四個(gè)大格中速殖子總數(shù)。速殖子濃度計(jì)算公式為：速殖子/ml=（四個(gè)大個(gè)格子內(nèi)的速殖子總數(shù)/4）×104殖子濃度時(shí)，加適量 PBS 稀釋，吹打均勻，顯微鏡下計(jì)數(shù)，直至物模型的建立機(jī)分為 10 組（8 個(gè)感染組，，1 個(gè)空白組和 1 個(gè) RH 標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)照組分別腹腔接種 ToxoDB#9 100、101、102、103、104、105、106、腹腔注射接種小鼠，接種前一日飲用水改為地塞米松液（10μg飼養(yǎng)，正常采食飲水。
【學(xué)位授予單位】：大理大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.7;R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2677998