【摘要】：2016年,美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)科研人員利用宏基因組測(cè)序技術(shù),在患有皮炎腎病綜合征(PDNS)和繁殖障礙的母豬及其流產(chǎn)胎兒體內(nèi)首次鑒定出一種新型豬圓環(huán)病毒,命名為豬圓環(huán)病毒3型(Porcinecircovirus3,PCV3)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)PCV3感染多見(jiàn)于具有PDNS和繁殖障礙癥狀豬群,目前已在美國(guó)多個(gè)州豬群內(nèi)普遍流行。同時(shí),美國(guó)舊金山市血液系統(tǒng)研究所的研究人員從3頭不明病因?qū)е碌男呐K和多器官炎癥仔豬體內(nèi)也檢測(cè)出PCV3。隨后,我國(guó)湖北、廣東等多個(gè)省市豬群中也檢測(cè)出PCV3。豬圓環(huán)病毒3型在全球范圍內(nèi)已經(jīng)普遍流行,快速、準(zhǔn)確地診斷豬群的感染狀況對(duì)防控本病具有重要的意義。本文通過(guò)對(duì)2008-2017年由本實(shí)驗(yàn)室保存的江蘇省部分地區(qū)141個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的272份疑似豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)的患病豬臨床樣品進(jìn)行PCV3回顧性調(diào)查;利用PCR技術(shù)或RT-PCR技術(shù)對(duì)組織樣品中PCV2、PCV3、PPV、PRV、CSFV和PRRSV各等病毒的混合感染情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果40份樣品鑒定為PCV3陽(yáng)性,占總數(shù)的14.7%(40/272);同時(shí)測(cè)定出4株P(guān)CV3的全基因序列。結(jié)果表明,2013至2017年間PCV3在江蘇部分地區(qū)豬群中已普遍存在。本文將PCV3 Cap蛋白的去核定位信號(hào)肽基因插入原核表達(dá)載體pET-28a中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),產(chǎn)生了具有免疫原性的融合蛋白。經(jīng)表達(dá)條件的優(yōu)化,表達(dá)的蛋白仍以包涵體形式存在。經(jīng)尿素變性、透析復(fù)性、陽(yáng)離子交換柱純化后的蛋白作為免疫原,免疫6周齡的BALB/c母鼠,再經(jīng)細(xì)胞融合、間接ELISA篩選、亞克隆后獲得1D3-6-25、1D3-11-39、1D3-5-10、1D3-32-61等8株能夠穩(wěn)定分泌針對(duì)PCV3 Cap蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。Western Blot與IFA試驗(yàn)結(jié)果表明,8株單抗都能對(duì)相應(yīng)的蛋白特異性識(shí)別。從8株單抗中,挑選3株制備腹水(1D3-14-57、1D3-29-72、1D3-11-39);經(jīng)間接ELISA的方法確定陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)即為其效價(jià),3株單抗的腹水效價(jià)分別為1:409600、1:204800和1:409600。選用野外感染PCV3毒株的豬腹股溝淋巴結(jié)做免疫組化,未免疫小鼠的血清作為陰性對(duì)照;同時(shí),將單抗腹水稀釋1000倍后作為一抗,1:8000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,鑒定單抗特異性。結(jié)果顯示3株單抗的腹水均具有較好的反應(yīng)性。
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分別為邋５６９邋ｂｐ、６４９邋ｂｐ、５１１邋ｂｐ、２７７邋ｂｐ、２８８邋ｂｐ、３７７邋ｂｐ、６４９邋ｂｐ邋（圖邋１－１）。逡逑為了獲得ＰＣＶ３全基因組序列，利用本章２．５中４對(duì)分段測(cè)序引物經(jīng)ＰＣＲ擴(kuò)增出特異逡逑性條帶（圖１－２）。通過(guò)１％瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的條帶送至安徽通用生物系統(tǒng)有限公逡逑司測(cè)序，將測(cè)序完成的四段序列拼接出ＰＣＶ３的全基因組序列。逡逑１邐２邐３邐４５邐６邐７邋Ｍ逡逑遍＊＆贏：＇！？焌雜悐淡}牐ご酪耪夥赍義賢跡保�？圌种病剁R模校茫依┰黿峁義希疲椋紓澹保卞澹校茫義澹幔恚穡歟椋媯椋悖幔簦椋錚鑠澹潁澹螅酰歟翦澹錚駑澹螅椋澹耄椋睿溴澹錚駑澹觶椋潁酰螅澹簀義希停哄澹保埃板澹猓皰澹模危鈴澹恚幔潁耄澹蟈義希保哄澹校茫鄭插澹校茫義澹穡潁錚洌酰悖翦危玻哄澹校茫鄭沖澹校茫義澹穡潁錚洌酰悖翦危常哄澹校校皺澹校茫義澹穡潁錚洌酰悖翦義希矗哄澹校遙皺澹校茫義澹穡潁錚洌酰悖翦危擔(dān)哄澹茫櫻疲皺澹校茫義澹穡潁錚洌酰悖翦危叮哄澹校遙遙櫻皺澹校茫義澹穡潁錚洌酰悖翦義希罰哄澹危澹紓幔簦椋觶邋澹悖錚睿簦潁錚戾義，

本文編號(hào)：2676926