【摘要】：近年來(lái)我國(guó)臨床上鴨乙型肝炎(Duck hepatitis B virus,DHBV)的危害日益加重。由于鴨乙型肝炎病毒呈垂直傳播,其在種鴨中的持續(xù)性感染可能對(duì)種蛋孵化和雛鴨造成較大的危害。本研究建立了檢測(cè)DHBV的核酸探針雜交檢測(cè)方法,并選取不同區(qū)域病死種鴨、肉鴨、死胚和弱雛進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,在此基礎(chǔ)上隨機(jī)選擇部分DHBV野毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序及序列分析,以期為養(yǎng)鴨業(yè)生產(chǎn)中DHBV的科學(xué)防控提供參考依據(jù)。本研究共分為四部分:1.DHBV在山東、江蘇兩地發(fā)病鴨群的PCR檢測(cè)從山東、江蘇兩個(gè)省份10個(gè)鴨群采集的臨床有發(fā)病癥狀的150只病死鴨的心、肝、脾、肺、腎五種臟器。以提取的組織DNA為模板用普通PCR方法檢測(cè)DHBV的感染情況并統(tǒng)計(jì)每個(gè)鴨群及各個(gè)內(nèi)臟器官的檢出率。結(jié)果表明DHBV的群體陽(yáng)性率為100%,個(gè)體陽(yáng)性率為41.3%。被檢測(cè)的器官中,肝臟的陽(yáng)性檢出率達(dá)100%,其他器官陽(yáng)性檢出率從高到低依次是心臟、脾臟、肺臟和腎臟,分別為77.4%、71.0%、67.7%和66.1%。2.DHBV核酸探針的制備與應(yīng)用將PCR擴(kuò)增后測(cè)序正確的DHBV C區(qū)的一段長(zhǎng)423bp的高度保守序列克隆制備成地高辛(DIG)標(biāo)記核酸探針。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明,制備的核酸探針只與DHBV的DNA雜交呈陽(yáng)性,與其他常見病原微生物的DNA雜交呈陰性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明,該探針對(duì)DHBV的最低檢出量約為3pg DHBV的DNA。應(yīng)用該探針對(duì)從山東、江蘇和安徽三個(gè)省份16個(gè)鴨群采集的150個(gè)死胚,150只弱雛以及臨床有發(fā)病癥狀的350只病死肉鴨和360只病死種鴨進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果個(gè)體陽(yáng)性率分別為52%、50.7%、46.9%和45.3%。同時(shí)對(duì)弱雛的12種內(nèi)臟器官以及成年鴨的5種器官組織DNA進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果在被檢測(cè)的器官中,肝臟的DHBV陽(yáng)性檢出率最高,達(dá)100%。將檢測(cè)結(jié)果與上述樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性個(gè)體檢出符合率為100%,而核酸探針檢測(cè)的各種器官檢出率略低于PCR檢測(cè)。結(jié)果表明,制備的DIG標(biāo)記的核酸探針特異性強(qiáng),靈敏度較高,適合對(duì)DHBV進(jìn)行大批量的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。3.DHBV野毒全基因組測(cè)序及基因進(jìn)化分析用普通PCR方法對(duì)發(fā)病最為嚴(yán)重的6個(gè)鴨群隨機(jī)選取的6株DHBV野毒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增并測(cè)序,隨后與其他15株GenBank已發(fā)表的全基因組序列進(jìn)行同源性分析和進(jìn)化樹構(gòu)建。序列分析結(jié)果表明,6株野毒全基因組序列之間的同源性在89.8~99.8%,與其他15株已發(fā)表的序列同源性在89.5~99.8%。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)6株野毒與中國(guó)分離株同屬一個(gè)分支。6株野毒之間的C蛋白氨基酸同源性在96.6~100%,與其他15株參考毒株同源性在96.2~100%;S蛋白氨基酸同源性在89.7~99.7%,與其他15株同源性在84.8~100%;P蛋白氨基酸同源性在85.3~99.6%,與其他15株同源性在84.8~99.5%。結(jié)合進(jìn)化樹分析可以發(fā)現(xiàn),C蛋白與其他毒株最相似,高度保守,S蛋白與P蛋白則異質(zhì)性較高。4.動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)100只3日齡的雛鴨肌肉注射6.6×10~5拷貝/μL的DHBV基因組的陽(yáng)性血清200μL,置于SPF隔離罩中飼養(yǎng),每次隨機(jī)抽取6只采血,采樣時(shí)間為攻毒后第2天、第3天、第4天、第5天、第7天、第9天、第12天,此后每隔一周采血一次,用SYBR GreenⅠ熒光定量方法檢測(cè)血液中DHBV病毒載量。檢測(cè)結(jié)果顯示在血液中第5天檢測(cè)出病毒,第12天病毒載量達(dá)到峰值,隨后逐漸下降,但試驗(yàn)期內(nèi)無(wú)自然轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象。剖檢可見花斑脾,肝臟出血。
【圖文】：

進(jìn)化樹可分為兩類，“中國(guó)基因型”分離株和“西方行分類以外，還可以根據(jù)血緣相似性進(jìn)行分類，根、RGHV、STHBV。對(duì)核苷酸序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)因型”分離株的型間差距為 9.8%，型內(nèi)差距為 5.99%子生物學(xué)特征因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)組長(zhǎng) 3021~3027bp，是由長(zhǎng)鏈（負(fù)鏈）和短鏈（正DNA，其所有基因都位于負(fù)鏈。正鏈的長(zhǎng)度不固定50%到 70%，并且沒有相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄翻譯功能。由 11 5’端，這個(gè)重復(fù)序列被命名為 DR2。DR2 同 DR1 一起的關(guān)鍵區(qū)域。有一個(gè)缺口存在于 DHBV 基因組的負(fù)的聚合酶分子（圖 1）。

鴨乙型肝炎病毒的流行病學(xué)調(diào)查與全基因組序列分析2 材料和方法2.1 材料2.1.1 病料和菌株來(lái)源本試驗(yàn)所用病料分別來(lái)自山東、江蘇和安徽三個(gè)省份 16 個(gè)鴨場(chǎng)（圖 2）共 30 個(gè)批次的 150 個(gè)死胚，150 只弱雛，，350 只肉鴨和 360 只種鴨。試驗(yàn)所用的番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus, MDPV）、鴨圓環(huán)病毒（duck circovirus, DuCV）、鴨瘟病毒（duck plague virus, DPV）、經(jīng)典鵝細(xì)小病毒（GPV）、鴨疫里默氏桿菌（Riemerellanatipestifer, RA）、大腸桿菌和沙門氏菌等病原均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)分子病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.32

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2676907