【摘要】：肌內脂肪(intramuscular fat,IMF)含量作為評價肉質品質的主要指標之一,在豬肉生產過程中非常重要,研究肌內脂肪細胞的脂肪沉積機制可以為畜牧生產提供數(shù)據支持。近年來已經有許多miRNAs在脂肪細胞增殖分化中發(fā)揮作用的研究,本實驗室前期通過高通量測序篩選出許多與脂肪沉積有關的miRNAs,結合ACSL家族成員在肌肉中的相對表達量的結果,通過靶基因在線預測軟件雙向預測:差異表達的miR-26a-5p和miR-223-3p與乙酰輔酶A合成酶3(ACSL3)可能存在靶向關系。本試驗通過雙熒光素報告酶系統(tǒng)驗證靶向關系,并利用差速貼壁法分離培養(yǎng)來源于背最長肌的豬肌內脂肪細胞,利用過表達,RT-qPCR等技術分析研究miRNA對豬肌內前體脂肪細胞的分化過程的調控作用。本試驗的主要結果:(1)沂蒙黑豬不同組織中ACSLs mRNA表達分析:ACSL1主要在肝臟中表達,ACSL3主要在肝臟和肌肉組織中表達,ACSL4主要在肝臟、脾臟中表達,ACSL5和ACSL6在各組織中表達量都較低;在高、低脂組的肌肉組織中,ACSL1、ACSL3、ACSL4均差異表達且達到顯著水平(P0.01),ACSL5和ACSL6雖有差異但不顯著。(2)ssc-miR-26a-5p和ssc-miR-223-3p在高、低脂組肝臟中均差異表達且達到極顯著水平,與高通量測序結果一致。在高、低脂組的肌肉組織中,ssc-miR-26a-5p和ssc-miR-223-3p以及基因ACSL3均差異表達且達到顯著水平。(3)雙熒光素酶系統(tǒng)報告基因試驗結果:將野生型的ACSL3 3蔝TR與miR-26a mimic轉染PK15細胞時,檢測到的螢火蟲熒光素酶信號與海腎熒光素酶信號的比值與其他對照組均相比顯著降低(P0.01)且其他各對照組之間無明顯差異,該結果表明,ACSL3 3蔝TR的種子序列可以與miR-26a-5p的種子序列結合猝滅螢火蟲熒光素酶的螢火信號使其與海腎熒光素酶信號的比值降低,從而確定ACSL3與miR-26a-5p存在直接的靶向關系;將ACSL3 3蔝TR野生型雙熒光素酶報告載體與miR-223-3p mimic轉染PK15細胞時,檢測到的螢火蟲熒光素酶信號與海腎熒光素酶信號的比值與其他各對照組之間無顯著差異,從而確定ACSL3與miR-223-3p不存在直接的靶向關系。(4)ACSL3 mRNA水平在IMF細胞分化前期逐漸上升,在分化第2d表達達到高峰(P0.05),隨后呈逐漸下降趨勢,在6d后進入平臺期。(5)轉染miR-26a-5p mimic/inhibitor可以影響原代肌內脂肪細胞中ACSL3 mRNA的表達:抑制miR-26a可以顯著上調ACSL3 mRNA的表達量(P0.01),過表達miR-26a可以下調ACSL3 mRNA的表達量。(6)過表達miR-26a可以使脂肪細胞分化標志基因PPARγ、SRREBP-1c表達量顯著下調(P0.01),表明過表達miR-26a-5p可以抑制豬肌內脂肪細胞的分化。(7)過表達miR-26a后,油紅O染色鑒定結果與TG含量測定結果均顯示合成脂滴顯著減少,表明過表達miR-26a-5p可以抑制豬肌內脂肪細胞脂滴合成。結論:miR-26a通過靶向結合基因ACSL3減少肌內脂肪細胞中甘油三酯(TG)的合成;miR-26a可以抑制豬肌內脂肪細胞的分化。研究結果為進一步研究miRNA對豬肌內脂肪沉積影響的機制提供研究基礎。
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重要因素(韋克林等,2012)，TG 在肌纖維細胞質中的脂滴中儲存的，穿插在纖維束間海燕，姜學，尹靖東,2009)。但在養(yǎng)殖廠豬育肥期間，一般是通過飼喂營養(yǎng)豐富的飼來增加機體內脂肪細胞體積的來完成脂質沉積(姚焰礎等,2010)。脂肪細胞是脂肪組織主要組成單位，一般認為前體脂肪細胞由內胚層間充質干細分化為脂肪干細胞，再分化為前體脂肪細胞，并保持一定的干性，如圖 1-1(Cawthoal.,2012)。隨后在體內一些成脂因子的作用下，梭形的前體脂肪細胞外形轉變?yōu)閳A形細胞內形成脂滴，此時前體脂肪細胞完成定向分化為成熟脂肪細胞的過(Gregoire,2001)。肌內脂肪細胞體積的增大，即脂肪的沉積，也是豬肉大理石紋形成基礎。肌內脂肪的沉積，主要指脂肪細胞經過一系列反應合成甘油三酯，最終以脂滴形態(tài)沉積在細胞內的過程：一分子甘油三酯由三分子脂肪酸和一個甘油骨架在體內經水縮合而成。與此同時，甘油三酯作為體內能量物質之一提供能量的的代謝速度也會向影響肌內脂肪的沉積。綜上，肌內脂肪的沉積總量是體內甘油三酯合成和代謝的綜調控結果(Farhad et al.,2018; Wu et al.,2010)。

ssc-miR-26a 靶向 ACSL3 調控豬肌內脂肪細胞的成脂分化節(jié)肝臟脂質穩(wěn)態(tài)的一種膜結合蛋白轉錄因子(李秀秀,2018)，主要調控脂肪酸、甘油三酯和膽固醇的生物合成，共包括 3 個亞型，分別為 SREBP-1a, SREBP-1c 和 SREBP-2。其中 SREBP1 優(yōu)先調控表達那些與脂肪酸合成有關的基因，而 SREBP-2 主要激活膽固醇的生物合成(Deng et al.,2012)。SREBP-1 及其靶基因的異常表達能夠引起胰島素抵抗、糖尿病和脂肪肝等一系列代謝性疾病(喬輝等,2015)。SREBP 大多以 SREBP-1c 亞基形式存在，一般在脂肪組織和肝臟組織中表達量比較高，SREBP-1c 是一種重要的調控肝臟中的脂肪代謝核轉錄因子(Frayn et al.,2006)。有研究表明，過表達 SREBP-1c 可以使HepG2 細胞中脂滴的數(shù)量變多和甘油三酯的含量上升(劉芳等,2018)。
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S828

【參考文獻】

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本文編號：2677098