【摘要】：肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)含量作為評(píng)價(jià)肉質(zhì)品質(zhì)的主要指標(biāo)之一,在豬肉生產(chǎn)過(guò)程中非常重要,研究肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的脂肪沉積機(jī)制可以為畜牧生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。近年來(lái)已經(jīng)有許多miRNAs在脂肪細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮作用的研究,本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)高通量測(cè)序篩選出許多與脂肪沉積有關(guān)的miRNAs,結(jié)合ACSL家族成員在肌肉中的相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果,通過(guò)靶基因在線預(yù)測(cè)軟件雙向預(yù)測(cè):差異表達(dá)的miR-26a-5p和miR-223-3p與乙酰輔酶A合成酶3(ACSL3)可能存在靶向關(guān)系。本試驗(yàn)通過(guò)雙熒光素報(bào)告酶系統(tǒng)驗(yàn)證靶向關(guān)系,并利用差速貼壁法分離培養(yǎng)來(lái)源于背最長(zhǎng)肌的豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞,利用過(guò)表達(dá),RT-qPCR等技術(shù)分析研究miRNA對(duì)豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程的調(diào)控作用。本試驗(yàn)的主要結(jié)果:(1)沂蒙黑豬不同組織中ACSLs mRNA表達(dá)分析:ACSL1主要在肝臟中表達(dá),ACSL3主要在肝臟和肌肉組織中表達(dá),ACSL4主要在肝臟、脾臟中表達(dá),ACSL5和ACSL6在各組織中表達(dá)量都較低;在高、低脂組的肌肉組織中,ACSL1、ACSL3、ACSL4均差異表達(dá)且達(dá)到顯著水平(P0.01),ACSL5和ACSL6雖有差異但不顯著。(2)ssc-miR-26a-5p和ssc-miR-223-3p在高、低脂組肝臟中均差異表達(dá)且達(dá)到極顯著水平,與高通量測(cè)序結(jié)果一致。在高、低脂組的肌肉組織中,ssc-miR-26a-5p和ssc-miR-223-3p以及基因ACSL3均差異表達(dá)且達(dá)到顯著水平。(3)雙熒光素酶系統(tǒng)報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果:將野生型的ACSL3 3蔝TR與miR-26a mimic轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞時(shí),檢測(cè)到的螢火蟲熒光素酶信號(hào)與海腎熒光素酶信號(hào)的比值與其他對(duì)照組均相比顯著降低(P0.01)且其他各對(duì)照組之間無(wú)明顯差異,該結(jié)果表明,ACSL3 3蔝TR的種子序列可以與miR-26a-5p的種子序列結(jié)合猝滅螢火蟲熒光素酶的螢火信號(hào)使其與海腎熒光素酶信號(hào)的比值降低,從而確定ACSL3與miR-26a-5p存在直接的靶向關(guān)系;將ACSL3 3蔝TR野生型雙熒光素酶報(bào)告載體與miR-223-3p mimic轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞時(shí),檢測(cè)到的螢火蟲熒光素酶信號(hào)與海腎熒光素酶信號(hào)的比值與其他各對(duì)照組之間無(wú)顯著差異,從而確定ACSL3與miR-223-3p不存在直接的靶向關(guān)系。(4)ACSL3 mRNA水平在IMF細(xì)胞分化前期逐漸上升,在分化第2d表達(dá)達(dá)到高峰(P0.05),隨后呈逐漸下降趨勢(shì),在6d后進(jìn)入平臺(tái)期。(5)轉(zhuǎn)染miR-26a-5p mimic/inhibitor可以影響原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中ACSL3 mRNA的表達(dá):抑制miR-26a可以顯著上調(diào)ACSL3 mRNA的表達(dá)量(P0.01),過(guò)表達(dá)miR-26a可以下調(diào)ACSL3 mRNA的表達(dá)量。(6)過(guò)表達(dá)miR-26a可以使脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ、SRREBP-1c表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.01),表明過(guò)表達(dá)miR-26a-5p可以抑制豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化。(7)過(guò)表達(dá)miR-26a后,油紅O染色鑒定結(jié)果與TG含量測(cè)定結(jié)果均顯示合成脂滴顯著減少,表明過(guò)表達(dá)miR-26a-5p可以抑制豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂滴合成。結(jié)論:miR-26a通過(guò)靶向結(jié)合基因ACSL3減少肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中甘油三酯(TG)的合成;miR-26a可以抑制豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究miRNA對(duì)豬肌內(nèi)脂肪沉積影響的機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。
【圖文】：

重要因素(韋克林等,2012)，TG 在肌纖維細(xì)胞質(zhì)中的脂滴中儲(chǔ)存的，穿插在纖維束間海燕，姜學(xué)，尹靖東,2009)。但在養(yǎng)殖廠豬育肥期間，一般是通過(guò)飼喂?fàn)I養(yǎng)豐富的飼來(lái)增加機(jī)體內(nèi)脂肪細(xì)胞體積的來(lái)完成脂質(zhì)沉積(姚焰礎(chǔ)等,2010)。脂肪細(xì)胞是脂肪組織主要組成單位，一般認(rèn)為前體脂肪細(xì)胞由內(nèi)胚層間充質(zhì)干細(xì)分化為脂肪干細(xì)胞，再分化為前體脂肪細(xì)胞，并保持一定的干性，如圖 1-1(Cawthoal.,2012)。隨后在體內(nèi)一些成脂因子的作用下，梭形的前體脂肪細(xì)胞外形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形細(xì)胞內(nèi)形成脂滴，此時(shí)前體脂肪細(xì)胞完成定向分化為成熟脂肪細(xì)胞的過(guò)(Gregoire,2001)。肌內(nèi)脂肪細(xì)胞體積的增大，即脂肪的沉積，也是豬肉大理石紋形成基礎(chǔ)。肌內(nèi)脂肪的沉積，主要指脂肪細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)合成甘油三酯，最終以脂滴形態(tài)沉積在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程：一分子甘油三酯由三分子脂肪酸和一個(gè)甘油骨架在體內(nèi)經(jīng)水縮合而成。與此同時(shí)，甘油三酯作為體內(nèi)能量物質(zhì)之一提供能量的的代謝速度也會(huì)向影響肌內(nèi)脂肪的沉積。綜上，肌內(nèi)脂肪的沉積總量是體內(nèi)甘油三酯合成和代謝的綜調(diào)控結(jié)果(Farhad et al.,2018; Wu et al.,2010)。

ssc-miR-26a 靶向 ACSL3 調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的成脂分化節(jié)肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的一種膜結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子(李秀秀,2018)，主要調(diào)控脂肪酸、甘油三酯和膽固醇的生物合成，共包括 3 個(gè)亞型，分別為 SREBP-1a, SREBP-1c 和 SREBP-2。其中 SREBP1 優(yōu)先調(diào)控表達(dá)那些與脂肪酸合成有關(guān)的基因，而 SREBP-2 主要激活膽固醇的生物合成(Deng et al.,2012)。SREBP-1 及其靶基因的異常表達(dá)能夠引起胰島素抵抗、糖尿病和脂肪肝等一系列代謝性疾病(喬輝等,2015)。SREBP 大多以 SREBP-1c 亞基形式存在，一般在脂肪組織和肝臟組織中表達(dá)量比較高，SREBP-1c 是一種重要的調(diào)控肝臟中的脂肪代謝核轉(zhuǎn)錄因子(Frayn et al.,2006)。有研究表明，過(guò)表達(dá) SREBP-1c 可以使HepG2 細(xì)胞中脂滴的數(shù)量變多和甘油三酯的含量上升(劉芳等,2018)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2677098