【摘要】：目前,研究表明,miR-148a-3p可以調(diào)控前體脂肪細(xì)胞的分化以及脂質(zhì)的形成;PTEN可以通過(guò)抑制PI3K-AKT信號(hào)通路抑制前體脂肪細(xì)胞分化;PTEN是miR-148a-3p的一個(gè)潛在的靶基因。本試驗(yàn)旨在建立體外家兔誘導(dǎo)分化模型以及驗(yàn)證miR-148a-3p可以靶向PTEN調(diào)控家兔前體脂肪細(xì)胞成脂分化。試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)miR-148a-3p在5月齡家兔腎周脂肪組織中的表達(dá)量極顯著高于初生仔兔(P0.01);(2)成功分離家兔前體脂肪細(xì)胞,雞尾酒法誘導(dǎo)成脂分化后,油紅O染色發(fā)現(xiàn)第二天出現(xiàn)大量的小脂滴,第六天開(kāi)始出現(xiàn)脂滴的匯聚,第十天時(shí),脂滴明顯增多,且大脂滴也明顯增多,出現(xiàn)成熟脂肪細(xì)胞的特征。標(biāo)志基因測(cè)定發(fā)現(xiàn),符合前體脂肪細(xì)胞分化規(guī)律。隨著前體脂肪細(xì)胞分化時(shí)間的推移,miR-148a-3p的表達(dá)量呈逐漸上調(diào)的趨勢(shì);(3)轉(zhuǎn)染miR-148a-3p類似物mimic后,細(xì)胞內(nèi)miR-148a-3p的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01)。誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞分化,結(jié)果顯示mimic可以促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化,脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4基因的mRNA水平均顯著上升(P0.05),脂肪酸和甘油三酯的含量極顯著增加(P0.01)。轉(zhuǎn)染miR-148a-3p抑制劑inhibitor,細(xì)胞內(nèi)miR-148a-3p的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞分化,結(jié)果顯示inhibitor可以抑制前體脂肪細(xì)胞分化,標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα和FABP4基因的mRNA水平均顯著降低(P0.05),脂肪酸和甘油三酯的含量極顯著降低(P0.05)。(4)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),PTEN基因是miR-148a-3p的一個(gè)潛在的靶基因,且有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-148a-3p可以作用PTEN基因的其中一個(gè)位點(diǎn)(P0.01),另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)并無(wú)靶向關(guān)系。(5)過(guò)表達(dá)miR-148a-3p后,可以下調(diào)PTEN基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(P0.01)。抑制表達(dá)miR-148a-3p后,可以上調(diào)PTEN基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(P0.05)。(6)抑制家兔前體脂肪細(xì)胞內(nèi)源性PTEN基因的表達(dá)量,PTEN表達(dá)量下降了約60%,可以促進(jìn)細(xì)胞成脂分化,上調(diào)脂肪酸的合成,甘油三脂的含量,分化相關(guān)基因C/EBPα、PPARγ和FABP4基因的mRNA水平均顯著上升(P0.05),與過(guò)表達(dá)miR-148a-3p實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜上所述,體外家兔誘導(dǎo)分化模型建立成功,且在家兔前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中,miR-148a-3p可以通過(guò)靶向PTEN基因促進(jìn)家兔前體脂肪細(xì)胞分化。
【圖文】：

8a-3p 在不同日齡家兔腎周脂肪中的表達(dá)水平（“*”表示 P≤示 P≤0.01；“***”表示 P≤0.005；“****”表示 P≤0.001）iR-148a-3p expression in perirenal fat of rabbits of differentP≤0.05; "**", P ≤0.01; "***", P ≤0.005; "****", P ≤ 0.001)體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)兔處死后，用酶消化法分離家兔前體脂肪細(xì)胞。接圓球狀漂浮在培養(yǎng)液中。接種 24h 后，大部分細(xì)胞已 后，細(xì)胞數(shù)量變多，形態(tài)更加穩(wěn)定，呈現(xiàn)出梭形、三別細(xì)胞細(xì)胞核周?chē)鷩@一圈呈花環(huán)狀的脂滴（圖 2，細(xì)胞數(shù)量不斷增多，細(xì)胞密度明顯增大，前體脂肪列(圖 2-C，圖 2-D)。結(jié)果表明前體脂肪細(xì)胞分離培

圖 2 家兔原代前體脂肪細(xì)胞的分離與培養(yǎng) （A）24h（100X）；（B）48h（200X）；（C）72h（100X）；（D）120h（100X）。Fig. 2, Isolation and culture of rabbit primary precursor adipose cells (A) For 24 hours(100X); (B) For 48 hours (200X); (C) For 72 hours (100X); (D) For 120 hours (100X)3.3 家兔原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化模型建立取凍存于液氮中的家兔原代前體脂肪細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)，待前體脂肪細(xì)胞密度達(dá)到 70%-80%時(shí)，用雞尾酒法誘導(dǎo)家兔前體脂肪細(xì)胞分化。并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、分化狀態(tài)。結(jié)果如圖 3-A 所示，由于接觸抑制生長(zhǎng)，細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入分化狀態(tài)，少部分細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始分化，并出現(xiàn)少量的橘紅色脂滴，少數(shù)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)花環(huán)狀脂滴，均勻的分散在整個(gè)培養(yǎng)皿中。原代前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 2 天后，染色后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)皿中橘紅色脂滴顯著增多，，變大，花環(huán)狀脂滴變多。原代前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 6 天后，培養(yǎng)皿中脂滴顯著增多，細(xì)胞內(nèi)的脂滴慢慢融合變大。原代前體脂
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S829.1

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本文編號(hào)：2676749