【摘要】：傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBD Virus,IBDV)引起的以免疫抑制為特征的一種急性接觸性傳染病,目前該病尚未得到有效控制,給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前主要通過接種疫苗預(yù)防此病的發(fā)生,主要疫苗有弱毒苗和滅活苗,弱毒苗免疫效果較好,但存在毒力返強(qiáng)和亞臨床癥狀出現(xiàn)的危險(xiǎn);滅活苗毒副作用較小,但免疫原性較低。所以研究和開發(fā)增強(qiáng)IBDV滅活苗的佐劑對(duì)有效防治IBDV的發(fā)生具有重要意義。近些年細(xì)胞因子類生物佐劑受到人們的廣泛關(guān)注,因?yàn)樵擃愖魟┎粌H具有天然細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)功能,同時(shí)具有毒副作用小、生物安全性高等特點(diǎn),可明顯增強(qiáng)多種疫苗的免疫效果。白介素-7是動(dòng)物體一種重要的多功能細(xì)胞因子,它不僅具有促進(jìn)B細(xì)胞、T細(xì)胞形成和發(fā)育的作用,同時(shí)還具有協(xié)調(diào)其他細(xì)胞因子提高機(jī)體免疫力的作用。過去我們研究證實(shí),白介素-7(IL-7)可明顯提高犬細(xì)小病毒DNA疫苗的免疫原性,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)重組雞IL-7(chIL-7)具有刺激機(jī)體提高抗IBDV和提高IBDV VP2 DNA疫苗免疫原性的活性。然而重組chIL-7是否具有增強(qiáng)IBDV滅活苗的免疫原性尚不清楚。為此,本論文通過制備重組chIL-7,分析了chIL-7對(duì)IBDV滅活苗的免疫增強(qiáng)作用。首先通過PCR從含有chIL-7 cDNA基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增chIL-7基因,并將其插入到原核表達(dá)載體pET-20b(+)中,構(gòu)建成與His標(biāo)簽融合的chIL-7原核分泌性表達(dá)載體pET20b-chIL-7/H。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21制備出工程菌,通過IPTG誘導(dǎo)使其表達(dá)。用Ni-NTA瓊脂糖膠粒純化chIL-7,用Wsetern-blot檢測chIL-7蛋白,用2E8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測chIL-7的生物活性。然后用IBDV滅活苗和不同劑量的chIL-7重組蛋白共同免疫雞,隔1周加強(qiáng)免疫1次。在免疫前和首免疫后不同時(shí)間采血并分離血清。通過ELISA檢測抗體滴度和中和抗體效價(jià),用MTT法檢測免疫30 d后雞脾臟淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù),用ELISA檢測培養(yǎng)基γ-干擾素、IL-4的含量。然后用IBDV強(qiáng)毒對(duì)免疫雞進(jìn)行攻毒,攻毒后8 d統(tǒng)計(jì)免疫雞的死亡率及疫苗的保護(hù)率,綜合評(píng)價(jià)chIL-7對(duì)IBDV滅活苗免疫原性的增強(qiáng)作用。結(jié)果表明,構(gòu)建的表達(dá)載體能夠介導(dǎo)chIL-7基因在大腸桿菌BL21中進(jìn)行分泌性表達(dá),制備的重組chIL-7具有生物活性。雞免疫結(jié)果顯示,chIL-7與IBDV滅活苗的共免疫組其血清的抗體滴度和中和抗體效價(jià)均顯著高于單獨(dú)免疫組;共免疫組雞淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和γ-干擾素表達(dá)水平也顯著高于單獨(dú)免疫組。動(dòng)物攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示,共免疫組雞的存活率(91%-97%)明顯高于單獨(dú)免疫組(78%),另外共免疫組的法氏囊指數(shù)、組織病變程度及感染組織的病毒滴度均低于單獨(dú)免疫組。由此可見,重組chIL-7可明顯增強(qiáng)IBDV滅活苗的免疫原性,提高滅活苗對(duì)免疫雞的保護(hù)率。這項(xiàng)研究為重組ch IL-7作為生物佐劑,在未來IBD病預(yù)防中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1 chIL-7 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of chIL-7 gene 2000 DNA Marker, 1: chIL-7 PCR 擴(kuò)增片段.2000 DNA Marker, 1: amplified chIL-7 fragment.表達(dá)載體的構(gòu)建 Xho I 酶切位點(diǎn)將 PCR 擴(kuò)增得到的 chIL-7 基因插到原建 pET20b-chIL-7/H 重組表達(dá)載體（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2676255