【摘要】：MLKL是一種假激酶蛋白,最初作為RIPK3的特異性底物被發(fā)現(xiàn),是目前發(fā)現(xiàn)介導細胞壞死性凋亡信號的最下游效應分子。由于MLKL的N端四螺旋束功能區(qū)具有與生物膜結(jié)合并介導生物膜打孔或透化的特性,因此MLKL被認為是細胞發(fā)生壞死性凋亡的執(zhí)行者。目前,關于MLKL生物學功能的報道主要集中于細胞死亡領域,其介導的細胞壞死性凋亡參與金黃色葡萄球菌的局部和全身性感染以及某些自身炎癥性疾病的發(fā)生。然而,MLKL是否參與調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障功能并不清楚。沙門菌感染引起的腸炎嚴重危害畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康,是全球重要的公共衛(wèi)生問題。研究調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫反應的分子機制,找到干預靶標,有利于沙門菌感染性腸炎的防控。本論文對MLKL在宿主防御沙門菌黏膜感染中的作用和機制進行了較為深入的研究。利用WT和MLKL~(-/-)小鼠構(gòu)建沙門菌感染性腸炎模型,首先分析MLKL是否影響宿主對沙門菌的易感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠對沙門菌黏膜感染更為易感,主要表現(xiàn)為小鼠存活率顯著降低、體重減輕更為明顯,且在沙門菌感染48h后,伴有以盲腸重量減輕、杯狀細胞減少、黏膜下層水腫明顯、腸上皮完整性破壞明顯、大量的炎性細胞浸潤以及炎性介質(zhì)產(chǎn)生等為主要特征的腸道病理損傷。由于沙門菌經(jīng)消化道進入宿主體內(nèi)后,突破腸道黏膜屏障并擴散至系統(tǒng)位點,引起宿主的胃腸炎、敗血癥及全身性感染(傷寒癥)等。因此,我們推測沙門菌感染后MLKL~(-/-)小鼠體現(xiàn)的嚴重腸道炎癥和全身癥狀可能伴隨細菌的大量定殖,實驗證實沙門菌感染48h后,MLKL~(-/-)小鼠盲腸組織和腸系膜淋巴結(jié)(腸道位點)與肝臟和脾臟(系統(tǒng)位點)均定殖了大量的細菌�？傊�,沙門菌感染后,MLKL~(-/-)小鼠存活率降低,組織損傷嚴重,炎性反應加劇,沙門菌入侵和擴散增多,說明MLKL有助于機體抗沙門菌黏膜感染。腸道黏膜屏障功能的完整性在防御腸道病原入侵和擴散中起重要作用。為了探究MLKL是否通過促進黏膜屏障功能完整和維護腸道穩(wěn)態(tài)實現(xiàn)其抗感染作用,我們進行如下實驗:首先,通過AB-PAS染色和免疫組織化學方法檢測盲腸組織中黏蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在沙門菌感染48h后,與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠盲腸組織中黏蛋白的表達顯著減少,且粘液的主要組成成分mucin 2表達也顯著減少,說明MLKL缺失導致腸道黏膜化學屏障受損更嚴重。腸上皮細胞的更替(增殖和凋亡)也是維護腸道組織平衡和屏障功能的要素,通過免疫熒光和TUNEL染色發(fā)現(xiàn),在沙門菌感染48h后,盡管兩種基因型小鼠腸上皮細胞的增殖無明顯差異,但MLKL~(-/-)小鼠腸上皮細胞的凋亡明顯增加,說明MLKL信號參與調(diào)節(jié)組織平衡以維持腸道黏膜層的完整,進而限制沙門菌的入侵。此外,通過實時熒光定量PCR、免疫組織化學和免疫蛋白印跡檢測盲腸組織中緊密連接蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在沙門菌感染48h后,盡管兩種基因型小鼠盲腸組織中occludin和ZO-1的表達無明顯差異,但與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠盲腸組織中claudin-3的表達顯著減少。與此同時,在體應用葡聚糖熒光探針檢測腸道滲透性的變化情況,發(fā)現(xiàn)在沙門菌感染48h后,與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠腸道的滲透性顯著增加,說明MLKL~(-/-)小鼠的腸道黏膜屏障功能更易被破壞。上述結(jié)果表明,在MLKL基因缺失后,腸道黏膜屏障功能和腸道穩(wěn)態(tài)更易被沙門菌所破壞。然而,上述結(jié)果還不能準確揭示MLKL的保護機制,例如不能明確脆弱的腸道黏膜屏障、過度的炎癥和增多的入侵沙門菌之間的因果關系,因此進行沙門菌急性感染實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在沙門菌感染6h后,與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠腸道位點的細菌定殖數(shù)量有明顯的增加趨勢,然而兩種基因型小鼠的腸炎并不顯著,且黏蛋白的表達也無明顯差異。盡管感染后MLKL~(-/-)小鼠盲腸組織中claudin-3的表達減少,但在未感染狀態(tài)下,兩種基因型小鼠盲腸組織中claudin-3的表達并無明顯差異。這些結(jié)果說明MLKL主要通過限制沙門菌在腸道黏膜的早期定殖,從而阻止腸道黏膜屏障功能和穩(wěn)態(tài)的破壞、抑制過度炎癥和阻止細菌向系統(tǒng)位點的擴散,起到抗沙門菌黏膜感染作用。MLKL如何限制沙門菌的早期定殖,是我們需要探究的新問題。首先,應用免疫組織化學方法分析MLKL的表達定位,發(fā)現(xiàn)在沙門菌感染后,p-MLKL主要表達于腸隱窩處的上皮細胞和浸潤的炎性細胞。腸上皮細胞和浸潤的單核巨噬細胞等炎性細胞均是腸道黏膜天然免疫的結(jié)構(gòu)基礎,表達多種模式識別受體(PRRs)識別病原和介導免疫應答反應,是構(gòu)成腸道黏膜免疫的第一道防線。然而,通過構(gòu)建WT/MLKL~(-/-)骨髓嵌合體小鼠,發(fā)現(xiàn)主要是腸道黏膜非造血細胞(腸上皮細胞)表達的MLKL限制沙門菌的早期定殖。近年來,炎性體是天然免疫研究領域的前沿課題,相繼發(fā)現(xiàn)腸上皮細胞表達的NLRP3、NLRC4和NLRP9b等多種炎性體在防御腸道病原如細菌、病毒或寄生蟲等感染中發(fā)揮重要作用,因此我們分析MLKL介導的抗感染保護作用是否依賴于炎性體信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在沙門菌感染6h和48h后,與WT小鼠相比,MLKL~(-/-)小鼠盲腸組織中炎性體信號被顯著抑制。同時,在MLKL基因缺失后,盲腸組織中炎性體活化依賴的IL-18分泌也顯著減少,回補外源的IL-18重組蛋白可顯著降低MLKL~(-/-)小鼠腸道位點和系統(tǒng)位點的沙門菌定殖數(shù)。上述結(jié)果說明腸道黏膜非造血細胞(腸上皮細胞)表達的MLKL通過促進炎性體信號活化,起到限制沙門菌在腸道黏膜早期定殖的作用。綜上所述,本論文證明了壞死性凋亡信號的效應分子MLKL通過促進腸道黏膜非造血細胞(腸上皮細胞)炎性體信號活化,限制沙門菌在腸道黏膜的早期定殖,并維護腸道穩(wěn)態(tài)和抑制感染性腸炎,從而實現(xiàn)其抗感染保護作用。
【圖文】：

圖 1.1 沙門菌突破腸道黏膜屏障的途徑引自 Anna Fa0brega, et al. (2013).門菌穿過腸道黏膜后，其會被吞噬細胞所吞噬。目前的研究表

物的入侵以及有害物質(zhì)的吸收；同時，腸道黏膜屏障可通過選擇性滲透和轉(zhuǎn)運，以吸收營養(yǎng)物質(zhì)。腸道黏膜屏障主要由細胞組分、細胞間組分以及非細胞組分（主動轉(zhuǎn)運、被動轉(zhuǎn)運和分泌生物活性物質(zhì)）構(gòu)成，以維持其功能的完整性（圖2.1）。圖 2.1 腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)示意圖引自 Mélanie Le Barz, et al. (2015).
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S855.1

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 薛穎;郭榮顯;錢珊珊;安樹敏;焦新安;耿士忠;;沙門菌毒力島的研究進展[J];微生物與感染;2015年06期

2 翟雙雙;;腸道黏膜屏障機能及其調(diào)控研究進展[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2014年07期

3 Simone CS Wolfkamp;Caroline Verseyden;Esther WM Vogels;Sander Meisner;Kirsten Boonstra;Charlotte P Peters;Pieter CF Stokkers;Anje A te Velde;;ATG16L1 and NOD2 polymorphisms enhance phagocytosis in monocytes of Crohn's disease patients[J];World Journal of Gastroenterology;2014年10期

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本文編號：2672091