【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是誘發(fā)奶牛乳腺炎最常見的病原菌之一。由于乳腺炎的感染受到多種因素影響,從多方面探索其遺傳調(diào)控機制有利于推進提高奶牛乳腺炎抗性的選擇育種。DNA甲基化是最為重要的表觀遺傳調(diào)控機制之一,對奶牛健康及生產(chǎn)具有重要影響。本研究在前期建立的S.aureus誘導型乳腺炎模型基礎(chǔ)上,對其乳腺組織進行全基因組DNA甲基化分析,探究DNA甲基化對S.aureus誘導型乳腺炎的潛在調(diào)控機制。本研究利用甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶測序技術(shù)(Methylation-dependent restriction-site associated DNA sequencing,Methyl-RAD Seq)對 S.aureus 誘導型乳腺炎動物模型試驗組和對照組乳腺組織DNA進行全基因組DNA甲基化測序。采用SOAP軟件根據(jù)參考基因組對質(zhì)控后序列進行比對注釋,用R包edge分析篩選差異甲基化位點和差異甲基化基因,而后采用R包Enricher對其進行功能富集分析。隨后與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析,篩選差異表達且差異甲基化的基因。用亞硫酸氫鹽克隆測序法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)對篩選的關(guān)鍵差異表達且差異甲基化基因的甲基化水平進一步分析。所得結(jié)果如下:1、中國荷斯坦牛全基因組DNA甲基化位點在染色體間非均勻分布,且主要集中于基因間區(qū)和內(nèi)含子內(nèi)�；蝮w的甲基化水平顯著高于其上下游區(qū)域,即DNA甲基化水平在轉(zhuǎn)錄起始位點前顯著增高并在轉(zhuǎn)錄終止位點后顯著下降。差異甲基化分析共發(fā)現(xiàn)差異CCGG甲基化位點9181個,其中荷斯坦牛S.aureus乳腺炎組相對于健康組,5722個甲基化位點甲基化水平顯著上調(diào),2459個甲基化位點顯著下調(diào)(P0.05,|log2FC|1);發(fā)現(xiàn)差異CCWGG甲基化位點1790個,其中1150個顯著上調(diào),640個顯著下調(diào)(P0.05,|log2FC|1)。以基因內(nèi)所有甲基化位點測序深度總和代表該基因甲基化水平,差異分析得到CCGG型甲基化差異基因363個(236個上調(diào),127個下調(diào)),和CCWGG型甲基化差異基因301個(177個上調(diào)甲基化和124個下調(diào)甲基化基因)(P0.05,|log2FC|1)。GO和KEGG功能分析顯示:差異CCGG甲基化基因與疾病免疫應(yīng)答相關(guān)通路緊密相關(guān),比如Toll樣受體4信號通路的陽性調(diào)節(jié)、Th17細胞分化、B細胞受體信號通路以及多條與各種疾病相關(guān)的通路。而差異CCWGG甲基化基因則對代謝相關(guān)過程具有重要調(diào)控作用,比如半乳糖代謝、脂肪細胞中脂肪分解以及淀粉和蔗糖代謝等。2、將全基因組DNA甲基化分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)526個CCGG甲基化和124個CCWGG甲基化差異基因的基因表達水平同時顯著差異(P0.05)。功能富集分析表明:差異表達的CCGG甲基化差異基因與細胞黏附、細胞遷移及疾病免疫應(yīng)答調(diào)控等密切相關(guān),進一步證明差異CCGG甲基化基因?qū).aureus乳腺炎的免疫應(yīng)答具有調(diào)控作用。3、根據(jù)上述分析篩選出對S.aureus乳腺炎具有調(diào)控潛能的關(guān)鍵差異甲基化基因CDH13、CXCRl、EPO 和 METTL13。CDH13 啟動子區(qū)、CXCR1、EPO 和 METTL13編碼區(qū)各預(yù)測到一個CpG島,分別檢測到13、16、16和33個CpG位點。其中,S.faureus乳腺炎組CXCR1編碼區(qū)519 bp處的CpG位點甲基化水平顯著低于對照組,其基因表達量顯著上調(diào)12倍,且該位點甲基化水平與其基因表達水平顯著負相關(guān)(P0.05)。CDH13啟動子區(qū)三個CpG位點(-162、-133和-93)的甲基化水平與其基因表達水平顯著負相關(guān),但是在S.aureus乳腺炎組與對照組之間差異不顯著。另外,CXCR1基因編碼區(qū)甲基化較高(90%),而EPO和METTL13基因甲基化水平很低(5%),與全基因組測序分析結(jié)果一致,驗證了全基因組DNA甲基化測序分析結(jié)果的準確性與可靠性。綜上所述,本研究從表觀遺傳組學的角度建立了中國荷斯坦牛S.aureus誘導型乳腺炎乳腺組織全基因DNA甲基化圖譜,篩選了S.aureu 乳腺炎相關(guān)的差異甲基化基因并進行功能分析,差異CCGG甲基化基因在S.aureus乳腺炎的免疫應(yīng)答中起重要調(diào)控作用。CXCR1編碼區(qū)519 bp處CpG位點甲基化水平降低促使其基因表達水平升高,這可能對S.aureus乳腺炎過程起調(diào)控機制。該結(jié)果為提高中國荷斯坦牛S.aureus乳腺炎抗性的表觀遺傳調(diào)控以及分子輔助選擇育種提供了科學依據(jù)。
【圖文】：

Ｍｅｔｈｙｌ－ＲＡＤ邋Ｓｅｑ甲基化標簽測序文庫，測序結(jié)果共產(chǎn)生８邋１２５邋６８５條ｒｅａｄｓ，平均測序逡逑ｒｅａｄｓ邋數(shù)為邋１３邋５２０邋９４８邋條（表邋２－３邋）。逡逑質(zhì)控后各樣本Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的堿基分布如圖２－３所示，各個位置上出現(xiàn)Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ／Ｎ的逡逑比列表明測序所得ｒｅａｄｓ均具有明顯的Ｇ／Ｃ富集峰值。各個樣本Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的測序質(zhì)量分逡逑布如圖２－４所不，Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的堿基質(zhì)量分數(shù)均較高（質(zhì)量分數(shù)彡３５），且質(zhì)控后Ｅｎｚｙｍｅ逡逑Ｒｅａｄｓ中高堿基質(zhì)量的ｒｅａｄｓ比例高達９９％邋（表２－３邋）。且經(jīng)過質(zhì)量控制后的各個文庫的逡逑Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ均占測序ｒａｗ邋ｒｅａｄｓ的９９％以上

邐９０邐５．２７逡逑圖２－２全基因組ＤＮＡ凝膠電泳圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｔｈｅ邋Ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｗｈｏｌｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ＤＮＡ逡逑２．３．２邋Ｍｅｔｈｙｌ－ＲＡＤ邋Ｓｅｑ甲基化標簽測序文庫數(shù)據(jù)產(chǎn)出逡逑通過Ｍｅｔｈｙｌ－ＲＡＤ邋Ｓｅｑ技術(shù)構(gòu)建了邋Ｓ．ａｗｒｅｗ誘導型乳腺炎試驗組和對照組共６個逡逑Ｍｅｔｈｙｌ－ＲＡＤ邋Ｓｅｑ甲基化標簽測序文庫，測序結(jié)果共產(chǎn)生８邋１２５邋６８５條ｒｅａｄｓ，平均測序逡逑ｒｅａｄｓ邋數(shù)為邋１３邋５２０邋９４８邋條（表邋２－３邋）。逡逑質(zhì)控后各樣本Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的堿基分布如圖２－３所示，，各個位置上出現(xiàn)Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ／Ｎ的逡逑比列表明測序所得ｒｅａｄｓ均具有明顯的Ｇ／Ｃ富集峰值。各個樣本Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的測序質(zhì)量分逡逑布如圖２－４所不，Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ的堿基質(zhì)量分數(shù)均較高（質(zhì)量分數(shù)彡３５），且質(zhì)控后Ｅｎｚｙｍｅ逡逑Ｒｅａｄｓ中高堿基質(zhì)量的ｒｅａｄｓ比例高達９９％邋（表２－３邋）。且經(jīng)過質(zhì)量控制后的各個文庫的逡逑Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ均占測序ｒａｗ邋ｒｅａｄｓ的９９％以上，含有預(yù)期酉每切位點的Ｅｎｚｙｍｅ邋Ｒｅａｄｓ占Ｃｌｅａｎ逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

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本文編號：2672148