發(fā)布時間：2020-05-20 00:43

【摘要】：犬瘟熱(Canine distemper)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起多種動物共患、多系統(tǒng)感染的高度接觸性傳染病。為獲得CDV野毒株(CDV-PS)截短磷蛋白(aa 232-507),本實(shí)驗(yàn)以Asia-1型CDV-PS毒株為基礎(chǔ),經(jīng)PCR擴(kuò)增得到P(aa 232-507)基因,連接到原核表達(dá)載體pEASY~(○R)-Blunt E1中,構(gòu)建重組原核表達(dá)載體E1-CDV-P。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行原核表達(dá)并對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。超聲破碎最佳條件下的誘導(dǎo)產(chǎn)物,經(jīng)離心后對重組蛋白進(jìn)行可溶性分析,隨后用Ni-NTA親和層析對重組截短P蛋白進(jìn)行純化并用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示:重組P蛋白大小約37 kDa,在IPTG終濃度0.1 mmol/L,誘導(dǎo)時間為8 h時,表達(dá)量最高;重組P蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定,成功純化出重組截短P蛋白;重組P蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。本研究成功制備出CDV-PS毒株截短P蛋白,為進(jìn)一步P蛋白抗原表位的研究和CDV抗體診斷方法的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。為獲得抗P(aa 232-507)蛋白的單克隆抗體,本研究用純化的P(aa 232-507)蛋白免疫BALB/c小鼠。利用細(xì)胞融合技術(shù)和間接ELISA抗體篩選方法,制備了4株抗CDV-PS毒株P(guān)(aa233-507)的單抗,分別命名為Pc7,Pc8,Pc11和Pc25。Western blot和IFA鑒定其均能與CDV-PS毒株的P蛋白(aa232-507)特異性反應(yīng)。但單抗Pc8不特異性識別CDV3疫苗株,說明單抗Pc8所識別的抗原表位在CDV-PS毒株和CDV3疫苗株之間存在著關(guān)鍵性位點(diǎn)的突變。單抗Pc25不特異性識別CDV-Rockborn疫苗株,說明單抗Pc25的抗原表位在CDV-PS毒株和CDV-Rockborn疫苗株之間也存在著關(guān)鍵性位點(diǎn)的突變。本研究成功制備出的抗CDV-PS毒株P(guān)(aa 232-507)蛋白單克隆抗體,為進(jìn)一步篩選4株單抗的線性抗原表位奠定基礎(chǔ)。為鑒定4株單抗的線性抗原表位,本研究通過肽掃描技術(shù)利用間接ELISA方法鑒定Pc7,Pc8,Pc11和Pc25的抗原表位。結(jié)果顯示單抗Pc7識別的抗原表位是~(238)SHGMGIVAGSTN~(249),單抗Pc8識別的抗原表位是~(264)GPSVSAENVRQ~(274),單抗Pc11識別的抗原表位是~(390)INPELRPIIGR~(400),單抗Pc25識別的抗原表位是~(252)TQSALKSTG~(260)�？乖砦槐葘Ψ治鼋Y(jié)果顯示,單抗Pc7的抗原表位在多個不同毒株中均有突變;單抗Pc25的抗原表位在Asia-1型(除CDV-ZC;140816外)、America-1型、Europe型毒株的相應(yīng)抗原表位區(qū)域沒有突變點(diǎn),而在Asia-2型和大部分America-2型毒株中均有突變;單抗Pc8的抗原表位在多個毒株中均有突變;單抗PC11所識別的線性B細(xì)胞表位在不同的CDV毒株中高度保守。本研究成功篩選了4株單抗所識別的線性抗原表位,為建立CDV的診斷方法奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1. 1 CDV 基因組結(jié)構(gòu)模式圖（Delpeut et al. 2012）Figure 1.1 CDV structure and genome編碼的蛋白大約由 15690 個核苷酸組成，從 3’端至 5’端依次是前導(dǎo)序列H 基因和 L 基因、尾隨序列（曹智剛, 2017）。CDV 基因組蛋白 V 和 C，編碼 V 和 C 的基因位于磷蛋白基因的內(nèi)部。白全長由 1 683 個核苷酸組成，其開放閱讀框（Open Reading Fra，編碼 523 個氨基酸（Campbell et al., 1980）。N 蛋白是 CDV衣殼的 90 %以上，，通過纏繞 CDV RNA 表面，以防 RNA 的分為氨基端的可變區(qū)、中間的高度保守區(qū)和羧基端的可變區(qū)氨基端的 80 個氨基酸殘基對于 CDV 進(jìn)入細(xì)胞核是必需的的空間結(jié)構(gòu)區(qū)域均存在能被抗 CDV N 蛋白單克隆抗體識別Yi 等（2016）通過 ELISA 實(shí)驗(yàn)和肽掃描技術(shù)，篩選鑒定出 RSYFDPA360。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)該表位在 CDV 各毒株間

反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)盒中陰性對照進(jìn)行12 % SDS-PAGE 白轉(zhuǎn)移至 NC 膜上，5 %脫脂乳室溫封閉孵育；用 TBST 洗滌 3 次，每次 10 孵育 1 h；用 TBST 洗滌 3 次，每次 1 擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條目的條帶，大小與預(yù)期（預(yù)期約為 符。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2671738