【摘要】：口蹄疫是一種由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度傳染性疾病。口蹄疫的爆發(fā)使受感染的家畜遭受嚴(yán)重生產(chǎn)損失,是一種在經(jīng)濟(jì)上具有毀滅性的疾病,它已經(jīng)成為國(guó)際動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品貿(mào)易的主要障礙。目前,全球有100多個(gè)國(guó)家仍然受到口蹄疫的影響,口蹄疫已經(jīng)被列為重大跨國(guó)動(dòng)物疫病的全球消滅計(jì)劃及生物武器安全公約組織重點(diǎn)檢查對(duì)象�？谔阋卟《镜母腥揪哂兴拗魇刃�,包括所有偶蹄類的家畜和野生反芻動(dòng)物以及豬都會(huì)發(fā)生疾病或長(zhǎng)期攜帶病毒,而奇蹄類動(dòng)物并不感染口蹄疫,如馬對(duì)口蹄疫病毒是具有高度抗性的動(dòng)物。即使被病毒污染了,也沒(méi)有疾病的癥狀和血清型特征。本研究利用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)牛的易感部位牛鼻咽部和馬的鼻咽部在感染口蹄疫病毒前后進(jìn)行比較研究,以期得到家畜口蹄疫易感性的遺傳基礎(chǔ)。為尋找口蹄疫的高效的免疫防治方法及利用先進(jìn)的基因操作技術(shù)精確改造家畜的特定基因,改善家畜的抗病性提供新的思路。全文研究結(jié)果如下:1.免疫組化檢測(cè)到牛和馬鼻咽部均表達(dá)口蹄疫病毒受體—整聯(lián)素蛋白(αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8)。2.口蹄疫病毒感染前后,牛鼻咽部轉(zhuǎn)錄組測(cè)序6個(gè)樣本的數(shù)據(jù)總量(clean data)均在12G以上,牛鼻咽部感染組(n=3)和對(duì)照組(n=3)比較,差異表達(dá)mRNA共有5967個(gè),上調(diào)的基因有3261個(gè),下調(diào)的基因有2706個(gè)。差異表達(dá)lncRNA共有143個(gè),上調(diào)的有40個(gè),下調(diào)的有103個(gè)。GO分類結(jié)果表明,富集到參與生物過(guò)程的基因有4705個(gè);參與細(xì)胞組分4788個(gè);參與分子功能5173個(gè)?差異表達(dá)mRNA轉(zhuǎn)錄本共富集得到上調(diào)基因顯著性通路38條和下調(diào)基因顯著性通路28條。這些通路與細(xì)胞代謝、免疫反應(yīng)、氨基酸的代謝、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、溶酶體等生理生化反應(yīng)有關(guān)。3.馬鼻咽部感染組(n=3)和對(duì)照組(n=3)比較,差異表達(dá)mRNA共有8658個(gè),上調(diào)的基因有4108個(gè),下調(diào)的基因有4550個(gè)。差異表達(dá)lncRNA共有576個(gè),上調(diào)的有410個(gè),下調(diào)的有166個(gè)。對(duì)馬鼻咽部差異基因進(jìn)行GO富集分析,參與生物過(guò)程的有1369個(gè);參與細(xì)胞組分1440個(gè);參與分子功能1598個(gè)?差異表達(dá)mRNA轉(zhuǎn)錄本共富集得到上調(diào)基因顯著性通路37條和下調(diào)基因顯著性通路44條。這些通路與粘附連接、免疫反應(yīng)、免疫疾病及病毒-宿主反應(yīng)、溶酶體等有關(guān)。4.利用RNA-seq技術(shù)對(duì)感染前后的牛鼻咽部組織進(jìn)行small RNA測(cè)序,鑒定到已知miRNA成熟體(mature)611個(gè);預(yù)測(cè)到novel miRNA成熟體(mature)187個(gè);感染組(BMV)和對(duì)照組(BM)的差異miRNA個(gè)數(shù)以及上調(diào)(UP)、下調(diào)(DOWN)miRNA個(gè)數(shù)分別為:56,30,26。對(duì)檢測(cè)到的已知miRNA和新miRNA進(jìn)行家族分析,經(jīng)聚類分析分為41個(gè)簇(cluster)和231個(gè)家族(family),利用動(dòng)物miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件得到了miRNA和靶基因間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。靶基因的生物學(xué)功能及其所富集到的通路顯示,其功能主要包括蛋白質(zhì)的定位、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞代謝過(guò)程、細(xì)胞外囊泡、上皮細(xì)胞的病菌侵入、趨化因子信號(hào)、吞噬作用等。此外,對(duì)差異表達(dá)的miRNA、lncRNA和mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。繪制了關(guān)鍵基因IRF8、CYCS、CASP3的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。5.對(duì)感染前后馬鼻咽部組織進(jìn)行small RNA測(cè)序。鑒定到已知miRNA成熟體(mature)414個(gè);預(yù)測(cè)到novel miRNA成熟體(mature)175個(gè);感染組(EMV)與對(duì)照組(EM)的差異miRNA個(gè)數(shù)以及上調(diào)、下調(diào)miRNA個(gè)數(shù)分別為:180,93,87。對(duì)檢測(cè)到的已知miRNA和新miRNA進(jìn)行家族分析,經(jīng)聚類分析分為41個(gè)簇(cluster)和207個(gè)家族(family),利用動(dòng)物miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件得到了miRNA和靶基因間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。靶基因的生物學(xué)功能及其所富集到的通路主要包括上皮細(xì)胞的病菌侵入、抗原的處理與提呈、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、泛素介導(dǎo)的蛋白水解等。對(duì)馬鼻咽部表達(dá)的差異miRNA、lncRNA和mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。繪制了關(guān)鍵基因TLR3、TLR4、TLR2、TRAF3、ATG9、GADD45A的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。6.通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)表達(dá)的差異基因進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)牛咽部在應(yīng)對(duì)口蹄疫病毒時(shí),主要是通過(guò)整聯(lián)素受體傳遞信號(hào)至細(xì)胞內(nèi),通過(guò)焦點(diǎn)粘附信號(hào)、細(xì)胞骨架信號(hào)和MAPK信號(hào)通路激活NF-κB,進(jìn)而激活了炎癥介質(zhì)的釋放和免疫反應(yīng),細(xì)胞骨架通路使細(xì)胞滲透性增加,胞內(nèi)蛋白外泄,病理表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)。在病毒清除方面,牛主要依靠線粒體途徑發(fā)生細(xì)胞凋亡,capase3切割激活Gasdermin家族成員Gasdermin E(DFNA5),細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)化為細(xì)胞焦亡使細(xì)胞裂解死亡。同時(shí),病毒對(duì)宿主的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)進(jìn)行阻斷,使得抗病毒物質(zhì)的分泌合成減少,病毒能夠逃避免疫反應(yīng)而復(fù)制和傳播。這些因素共同促成了牛對(duì)口蹄疫病毒易感且出現(xiàn)臨床癥狀。雖然馬的鼻咽組織中也有整聯(lián)素受體表達(dá),但馬清除病毒和對(duì)抗病毒的機(jī)制主要是:通過(guò)模式識(shí)別受體TLR4、TLR3,激活TRAM-TRIF-IRF3通路參與抗病毒反應(yīng);在馬鼻咽部組織受到病毒刺激時(shí),β-防御素(BD-1)在阻止病毒進(jìn)入馬時(shí)發(fā)揮著特殊作用;TLR結(jié)合配體后,其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,細(xì)胞的自噬被激活,自噬可以作為一種防御機(jī)制清除病原體;病毒在細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白可能通過(guò)自噬-溶酶體途徑進(jìn)行降解排出細(xì)胞;馬的細(xì)胞并未發(fā)生細(xì)胞炎癥性死亡且病毒并沒(méi)有阻斷馬的轉(zhuǎn)錄翻譯起始系統(tǒng)。TLR2、TLR3均可以激活TSLP分泌,正常情況下,TSLP通過(guò)與樹(shù)突細(xì)胞表面的受體TSLPR(CRLF2)結(jié)合,誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),但馬接觸病毒后,由于TSLPR表達(dá)沉默,炎癥反應(yīng)并未被誘導(dǎo)。所以我們推測(cè),上述因素共同導(dǎo)致了馬是一種具有口蹄疫病毒抗性的家畜。所以,在轉(zhuǎn)錄組水平,上述基因表達(dá)及其非編碼RNA調(diào)控因素的不同,使得牛和馬在接觸口蹄疫病毒時(shí)啟動(dòng)了不同應(yīng)對(duì)機(jī)制從而表現(xiàn)出不同的易感機(jī)制和抗病性能。此外,為了證實(shí)測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性,對(duì)部分關(guān)鍵基因進(jìn)行了熒光定量PCR的數(shù)據(jù)驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2671561