【摘要】：口蹄疫是一種由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度傳染性疾病�？谔阋叩谋l(fā)使受感染的家畜遭受嚴重生產(chǎn)損失,是一種在經(jīng)濟上具有毀滅性的疾病,它已經(jīng)成為國際動物和動物產(chǎn)品貿(mào)易的主要障礙。目前,全球有100多個國家仍然受到口蹄疫的影響,口蹄疫已經(jīng)被列為重大跨國動物疫病的全球消滅計劃及生物武器安全公約組織重點檢查對象�？谔阋卟《镜母腥揪哂兴拗魇刃�,包括所有偶蹄類的家畜和野生反芻動物以及豬都會發(fā)生疾病或長期攜帶病毒,而奇蹄類動物并不感染口蹄疫,如馬對口蹄疫病毒是具有高度抗性的動物。即使被病毒污染了,也沒有疾病的癥狀和血清型特征。本研究利用全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對牛的易感部位牛鼻咽部和馬的鼻咽部在感染口蹄疫病毒前后進行比較研究,以期得到家畜口蹄疫易感性的遺傳基礎。為尋找口蹄疫的高效的免疫防治方法及利用先進的基因操作技術(shù)精確改造家畜的特定基因,改善家畜的抗病性提供新的思路。全文研究結(jié)果如下:1.免疫組化檢測到牛和馬鼻咽部均表達口蹄疫病毒受體—整聯(lián)素蛋白(αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8)。2.口蹄疫病毒感染前后,牛鼻咽部轉(zhuǎn)錄組測序6個樣本的數(shù)據(jù)總量(clean data)均在12G以上,牛鼻咽部感染組(n=3)和對照組(n=3)比較,差異表達mRNA共有5967個,上調(diào)的基因有3261個,下調(diào)的基因有2706個。差異表達lncRNA共有143個,上調(diào)的有40個,下調(diào)的有103個。GO分類結(jié)果表明,富集到參與生物過程的基因有4705個;參與細胞組分4788個;參與分子功能5173個?差異表達mRNA轉(zhuǎn)錄本共富集得到上調(diào)基因顯著性通路38條和下調(diào)基因顯著性通路28條。這些通路與細胞代謝、免疫反應、氨基酸的代謝、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、溶酶體等生理生化反應有關。3.馬鼻咽部感染組(n=3)和對照組(n=3)比較,差異表達mRNA共有8658個,上調(diào)的基因有4108個,下調(diào)的基因有4550個。差異表達lncRNA共有576個,上調(diào)的有410個,下調(diào)的有166個。對馬鼻咽部差異基因進行GO富集分析,參與生物過程的有1369個;參與細胞組分1440個;參與分子功能1598個?差異表達mRNA轉(zhuǎn)錄本共富集得到上調(diào)基因顯著性通路37條和下調(diào)基因顯著性通路44條。這些通路與粘附連接、免疫反應、免疫疾病及病毒-宿主反應、溶酶體等有關。4.利用RNA-seq技術(shù)對感染前后的牛鼻咽部組織進行small RNA測序,鑒定到已知miRNA成熟體(mature)611個;預測到novel miRNA成熟體(mature)187個;感染組(BMV)和對照組(BM)的差異miRNA個數(shù)以及上調(diào)(UP)、下調(diào)(DOWN)miRNA個數(shù)分別為:56,30,26。對檢測到的已知miRNA和新miRNA進行家族分析,經(jīng)聚類分析分為41個簇(cluster)和231個家族(family),利用動物miRNA靶基因預測軟件得到了miRNA和靶基因間的對應關系。靶基因的生物學功能及其所富集到的通路顯示,其功能主要包括蛋白質(zhì)的定位、蛋白質(zhì)運輸、胞內(nèi)運輸、細胞代謝過程、細胞外囊泡、上皮細胞的病菌侵入、趨化因子信號、吞噬作用等。此外,對差異表達的miRNA、lncRNA和mRNA數(shù)據(jù)進行了關聯(lián)分析。繪制了關鍵基因IRF8、CYCS、CASP3的調(diào)控網(wǎng)絡。5.對感染前后馬鼻咽部組織進行small RNA測序。鑒定到已知miRNA成熟體(mature)414個;預測到novel miRNA成熟體(mature)175個;感染組(EMV)與對照組(EM)的差異miRNA個數(shù)以及上調(diào)、下調(diào)miRNA個數(shù)分別為:180,93,87。對檢測到的已知miRNA和新miRNA進行家族分析,經(jīng)聚類分析分為41個簇(cluster)和207個家族(family),利用動物miRNA靶基因預測軟件得到了miRNA和靶基因間的對應關系。靶基因的生物學功能及其所富集到的通路主要包括上皮細胞的病菌侵入、抗原的處理與提呈、肌動蛋白細胞骨架調(diào)控、泛素介導的蛋白水解等。對馬鼻咽部表達的差異miRNA、lncRNA和mRNA數(shù)據(jù)進行了關聯(lián)分析。繪制了關鍵基因TLR3、TLR4、TLR2、TRAF3、ATG9、GADD45A的調(diào)控網(wǎng)絡。6.通過生物信息學對表達的差異基因進行分析,我們發(fā)現(xiàn)牛咽部在應對口蹄疫病毒時,主要是通過整聯(lián)素受體傳遞信號至細胞內(nèi),通過焦點粘附信號、細胞骨架信號和MAPK信號通路激活NF-κB,進而激活了炎癥介質(zhì)的釋放和免疫反應,細胞骨架通路使細胞滲透性增加,胞內(nèi)蛋白外泄,病理表現(xiàn)出炎癥反應。在病毒清除方面,牛主要依靠線粒體途徑發(fā)生細胞凋亡,capase3切割激活Gasdermin家族成員Gasdermin E(DFNA5),細胞凋亡轉(zhuǎn)化為細胞焦亡使細胞裂解死亡。同時,病毒對宿主的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)進行阻斷,使得抗病毒物質(zhì)的分泌合成減少,病毒能夠逃避免疫反應而復制和傳播。這些因素共同促成了牛對口蹄疫病毒易感且出現(xiàn)臨床癥狀。雖然馬的鼻咽組織中也有整聯(lián)素受體表達,但馬清除病毒和對抗病毒的機制主要是:通過模式識別受體TLR4、TLR3,激活TRAM-TRIF-IRF3通路參與抗病毒反應;在馬鼻咽部組織受到病毒刺激時,β-防御素(BD-1)在阻止病毒進入馬時發(fā)揮著特殊作用;TLR結(jié)合配體后,其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,細胞的自噬被激活,自噬可以作為一種防御機制清除病原體;病毒在細胞內(nèi)合成的蛋白可能通過自噬-溶酶體途徑進行降解排出細胞;馬的細胞并未發(fā)生細胞炎癥性死亡且病毒并沒有阻斷馬的轉(zhuǎn)錄翻譯起始系統(tǒng)。TLR2、TLR3均可以激活TSLP分泌,正常情況下,TSLP通過與樹突細胞表面的受體TSLPR(CRLF2)結(jié)合,誘導產(chǎn)生Th2介導的炎癥反應,但馬接觸病毒后,由于TSLPR表達沉默,炎癥反應并未被誘導。所以我們推測,上述因素共同導致了馬是一種具有口蹄疫病毒抗性的家畜。所以,在轉(zhuǎn)錄組水平,上述基因表達及其非編碼RNA調(diào)控因素的不同,使得牛和馬在接觸口蹄疫病毒時啟動了不同應對機制從而表現(xiàn)出不同的易感機制和抗病性能。此外,為了證實測序數(shù)據(jù)的可靠性,對部分關鍵基因進行了熒光定量PCR的數(shù)據(jù)驗證,驗證結(jié)果與測序結(jié)果一致。
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 王猛;劉永生;張杰;;口蹄疫病毒蛋白與細胞凋亡[J];中國農(nóng)學通報;2010年22期

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3 吳海祥,鄭從義,屈三甫,郭荊哲,王燕麗;口蹄疫病毒誘導宿主細胞凋亡的研究[J];中國病毒學;2001年02期

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本文編號：2671561