【摘要】：新型鵝細(xì)小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)是一種能夠引發(fā)鴨的“喙萎縮-侏儒癥(beak atrophy and dwarfism syndrome,BADS)”的病原,該病能導(dǎo)致番鴨大舌且短喙、生長(zhǎng)緩慢或侏儒。NGPV多導(dǎo)致10-30 d齡左右的肉鴨感染,雖然死亡率與發(fā)病率較低,但是導(dǎo)致我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)殘鴨、僵鴨高達(dá)60%左右的淘汰率,使國(guó)產(chǎn)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失重大。新型鵝細(xì)小病毒的VP3蛋白含有病毒的主要抗原決定簇,構(gòu)成該病毒的主要抗原表位,而且在病毒的吸附以及病毒侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中都起著重要作用。本研究用PCR方法擴(kuò)增NGPV的VP3基因,然后連接到原核表達(dá)載體pCold-TF上,轉(zhuǎn)化入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,成功構(gòu)建VP3基因表達(dá)載體pCold-VP3,高效表達(dá)重組蛋白VP3;并利用His標(biāo)簽純化的方法得到高純度的重組蛋白VP3;該蛋白在E.coli BL21細(xì)胞中以可溶性形式表達(dá);VP3蛋白分子量大小為110 kDa,Western blot和間接免疫熒光鑒定結(jié)果表明重組蛋白VP3可與新型鵝細(xì)小病毒的特異單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng),表明原核表達(dá)的重組蛋白VP3具有良好的免疫原性,從而篩選出免疫效果好的單抗1-5和單抗1-7,這兩種單抗可以高效鑒定NGPV,為以后開(kāi)發(fā)ELISA診斷試劑檢測(cè)NGPV奠定有利基礎(chǔ)。根據(jù)NCBI基因庫(kù)中VP3基因序列,對(duì)VP3基因的內(nèi)部片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到分子量為143bp的VP3基因片段,以pMD19-T質(zhì)粒為載體,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-143。將陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線、進(jìn)行特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和重復(fù)性檢測(cè)試驗(yàn)。研究結(jié)果表明,熒光定量的反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃延伸34 s,40 cycles,上下游引物濃度為0.4μmol/L、探針濃度為0.8μmol/L時(shí),熒光定量效果最佳。本研究建立的NGPV的熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系相關(guān)系數(shù)均在0.990以上;檢測(cè)敏感性達(dá)到37.2拷貝/μL,比常規(guī)PCR靈敏度高100倍,具有良好的特異性;批內(nèi)和批間的重復(fù)性檢測(cè)變異系數(shù)均小于2.2%,重復(fù)性好;因此利用熒光定量PCR方法檢測(cè)新型鵝細(xì)小病毒,敏感性明顯高于普通常規(guī)PCR方法。該方法具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn),可初步用于NGPV疫情的快速診斷。
【圖文】：

25源新型鵝細(xì)小病毒 VP-1 PCR-amplified E g質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)rker(DL2000); 1:PCR大小為 2000 到 10，與預(yù)期片段大小Cold-VP3 的鑒定體 pCold-VP3 用內(nèi)，，電泳結(jié)果(見(jiàn)圖

2 重組質(zhì)粒 pCold-VP3 雙酶estion identification of the rec標(biāo)準(zhǔn)（DL5000、DL2000） Marker;1:pCold- VP3 Bienz小為 1000 bp 到 2000 b亮條帶。通過(guò)對(duì)處于 20，與目的基因 VP3 基因及 SDS-PAGE 分析-VP3，轉(zhuǎn)化 BL21 大腸桿液體培養(yǎng)基里加 IPTG 誘菌感受態(tài)細(xì)胞。將兩種培 凝膠電泳，SDS-PAGE
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2671514