【摘要】：近年來,我國集約化牛場高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后能量負(fù)平衡較為普遍,卵巢靜止性乏情率較高,嚴(yán)重影響奶牛繁殖性能,降低了奶牛生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)價值。然而,目前高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后能量負(fù)平衡導(dǎo)致卵巢靜止發(fā)生的蛋白組學(xué)機(jī)制不明,并缺乏相應(yīng)的預(yù)警技術(shù)。因此,本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)開展卵巢靜止奶牛血液蛋白標(biāo)識物的篩選及關(guān)鍵因子的信號通路研究,旨在揭示所獲得的蛋白在卵巢靜止發(fā)生中的作用,為建立該病風(fēng)險預(yù)警體系奠定基礎(chǔ)。本實驗選取產(chǎn)后14-21天能量正平衡(PEB)和能量負(fù)平衡(NEB)荷斯坦奶牛,跟蹤至其產(chǎn)后60-90天,通過發(fā)情表現(xiàn)、直腸檢查和B超檢查后,按判定標(biāo)準(zhǔn)將實驗?zāi)膛７譃槁殉察o止組(IO),正常發(fā)情對照組(CON),每組50頭采集血清。另外,在屠宰場收集來自同品種、背景相近、無繁殖疾病、產(chǎn)后健康的經(jīng)產(chǎn)奶牛卵泡顆粒細(xì)胞,根據(jù)卵泡直徑分為三組,大卵泡(L)、中卵泡(M)、小卵泡(S),每組10個樣品。此外,在IO組和CON組中,每組隨機(jī)選取15頭奶牛血清用于蛋白質(zhì)組學(xué)實驗,另外35頭奶牛血清用于ELISA檢測的驗證實驗。試驗結(jié)果如下:1.應(yīng)用iTRAQ/LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)篩選出23種與能量負(fù)平衡相關(guān)的血清差異表達(dá),其中NEB組表達(dá)上調(diào)的有16種,表達(dá)下調(diào)的有7種。根據(jù)生物信息學(xué)結(jié)果提示,這些差異表達(dá)蛋白多與脂類代謝(APOA1、APOA5、APOF、TTR)、蛋白酶復(fù)合體系統(tǒng)(PSMA2、PSMA4、PSMA7 和 PSMB1),及糖酵解(SORD 和 GAPDH)相關(guān);2.經(jīng)產(chǎn)后60-90天奶牛血液生殖激素分析揭示,能量負(fù)平衡能夠引起生殖激素分泌紊亂(FSH和E2的濃度降低),是引起奶牛卵巢靜止的原因之一;3.應(yīng)用iTRAQ/LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對奶牛卵巢靜止血清蛋白組學(xué)的研究,共獲到61種差異表達(dá)蛋白。其中與卵巢靜止相關(guān)的14種差異表達(dá)蛋白。經(jīng)免疫印跡和/或ELISA方法驗證的10種差異蛋白中ADIPOQ、IGFBP2和RBP4會通過影響生殖激素生物過程而影響卵泡發(fā)育,GPX3會通過氧化應(yīng)激而影響卵泡發(fā)育,且驗證結(jié)果與組學(xué)結(jié)果一致;4.為了獲得與卵巢靜止直接相關(guān)的代謝通路及代謝通路的作用機(jī)制,實驗選取不同大小卵泡研究糖代謝在卵泡顆粒細(xì)胞中的作用,發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞內(nèi)糖酵解的關(guān)鍵限速酶HK、PEK和差異蛋白ALDOB在從小到大的卵泡中先升高再降低,而關(guān)鍵限速酶PKM2和差異蛋白LDHB 一直降低,提示糖酵解在卵泡發(fā)育早期發(fā)揮作用,且一旦發(fā)生紊亂能夠成為卵巢靜止發(fā)生的主要病因之一;5.為了建立卵巢靜止的預(yù)警體系,實驗對產(chǎn)后60-90天IO組和CON組奶牛血液中3種能量指標(biāo)、4種生殖激素以及10種關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白,經(jīng)過相關(guān)性分析、二元邏輯回歸建模以及ROC分析,建立了基于APOA4和ITIH3的單一指標(biāo)的預(yù)警技術(shù),其預(yù)警值分別為APOA428.825 μg/L,ITIH3195.07ng/L;建立了基于APOA4+ITIH3+E2潛在生物標(biāo)志物的多指標(biāo)預(yù)警體系,其預(yù)警值為:APOA447.56μg/L,ITIH4187.80ng/L,E269.63ng/L;6.通過對卵巢靜止發(fā)生機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,提示能量負(fù)平衡所致的卵巢靜止與機(jī)體多種代謝異常相關(guān)聯(lián),包括脂類代謝、氧化應(yīng)激、維生素代謝、胰島素及IGF系統(tǒng),以及卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的形成等。說明了能量負(fù)平衡所致的奶牛產(chǎn)后卵巢靜止發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性。結(jié)論:1)通過對能量負(fù)平衡蛋白組學(xué)的分析,提示能量負(fù)平衡與脂類代謝、糖類代謝及蛋白酶復(fù)合體存在密切相關(guān);2)明確了糖酵解過程在對卵泡發(fā)育的作用,推測糖酵解的紊亂時引起卵巢靜止的主要原因之一;3)建立了卵巢靜止發(fā)生風(fēng)險預(yù)警體系,確定了單一指標(biāo)和多指標(biāo)的預(yù)警值;4)構(gòu)建了卵巢靜止發(fā)生的代謝網(wǎng)絡(luò)圖,提示卵巢靜止發(fā)生的多重病因理論,為今后卵巢靜止發(fā)生機(jī)制和防治的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｇｒｏｕｐ，邋ａｎｄ邋ａ邋ｎｅｕｔｒａｌ邋ｂａｌａｎｃｅ邋ｐｏｒｔｉｏｎ邋ｔｏ邋ｍａｉｎｔａｉｎ邋ａｎ邋ｏｖｅｒａｌｌ邋ｍａｓｓ邋ｏｆ邋１４５逡逑ｉＴＲＡＱ試劑結(jié)構(gòu)為同量異位標(biāo)簽，由帶電的報告基團(tuán)組成，每種試劑中報告基團(tuán)對應(yīng)逡逑每一個樣品。肽反應(yīng)基團(tuán)和中性平衡基團(tuán)以保持總質(zhì)量１４５邋（圖１－３）。這些獨(dú)特的試劑在逡逑ＭＳ／ＭＳ碎裂后產(chǎn)生相應(yīng)的、獨(dú)特的報告離子（荷質(zhì)比：四標(biāo)：１１４－１１７；六標(biāo)：１１４－１１９：逡逑八標(biāo)：１１４－１２１），用于量化它們各自的樣品。ＭＳ／ＭＳ碎裂除了提供強(qiáng)烈的報告離子信號逡逑夕卜，還可以產(chǎn)生ｙ－和ｂ－離子，而不會改變?nèi)魏翁囟牡碾姾蔂顟B(tài)，從而在定量的同時可以逡逑更可靠的鑒定蛋白質(zhì)。逡逑肽反應(yīng)基團(tuán)設(shè)計為能夠與所有伯胺進(jìn)行反應(yīng)，包括賴氨酸側(cè)鏈的Ｎ－端和ｅ－氨基基團(tuán)，逡逑以在多種不同生物樣品中標(biāo)記所有肽，從而增強(qiáng)任何給定蛋白質(zhì)的肽覆蓋，同時允許保留逡逑其他重要的結(jié)構(gòu)信息，例如翻譯后修飾。逡逑１１逡逑

逡逑圖１－４以４標(biāo)為例的ｉＴＲＡＱ試劑的工作流程，每個單獨(dú)的樣品被還原、烷基化，并用逡逑胰蛋白酶進(jìn)行酶促消化，然后將得到的肽池分別在一組平行的反應(yīng)中標(biāo)記、合并，然后通逡逑過液相－質(zhì)譜／質(zhì)譜（Ｌｉｑｕｉｄ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，，邋ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）逡逑聯(lián)用的方法進(jìn)行分析。所獲得的混合物在ＭＳ中產(chǎn)生一組未處理的前體離子，進(jìn)而達(dá)到對逡逑樣品中低豐度蛋白的增強(qiáng)作用。在ＭＳ中產(chǎn)生的親本片段經(jīng)過處理后，四個報告基團(tuán)離子逡逑在荷質(zhì)比１１４－１１７之間顯現(xiàn)為不同的質(zhì)量。逡逑￣＞？邋ＥＩＭｉ］－ｐＴＣ邋＋逡逑‘各 …口量鎮(zhèn)逡逑——＾邐Ｊ邋－Ｒｅｐｏｒｔｅｒ－Ｂａｌａｎｃｅ－Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ＩＮＴＡＣＴ邐－邋Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋ＥＱＵＡＬ逡逑－邋４邋ｓａｍｐｔｅｓ邋ｉｄｅｎｔｉｃａｌ邋ｍ／ｚ邐－邋Ｒｅｐｏｒｔｅｒ邋ｉｏｎｓ邋ＤＩＦＦＥＲＥＮＴ逡逑圖１－４四標(biāo)試劑的多重反應(yīng)方案逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｇｅｎｅｒａｌ邋ｓｃｈｅｍｅ邋ｏｆ邋ａ邋ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋（Ｓ１－Ｓ４），逡逑ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｏｕｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｌｏｕｒｓ．逡逑ｉＴＲＡＱ試劑拓展了研究蛋白質(zhì)差異表達(dá)的動態(tài)能力，它能提供多種樣本中蛋白的定量逡逑信息，包括時間過程分析及疾病標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)和闡明。由于樣本中的大多數(shù)肽都適用于該標(biāo)逡逑記策略
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.23

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 程云;中藥促孕灌注液對奶牛卵巢靜止的療效驗證[J];畜牧與獸醫(yī);1989年03期

2 王愛春;;低功率激光療法對乳牛卵巢靜止的效果[J];青海畜牧獸醫(yī)雜志;1989年01期

3 高淑英;;母畜卵巢靜止和卵巢囊腫的診治[J];黑龍江動物繁殖;2015年06期

4 侯樂樂;代永聯(lián);郝小靜;張廷榮;;奶牛卵巢靜止及其中西療法的療效比較[J];北方牧業(yè);2014年11期

5 鐘清蓮，林峰，林嵩海;母牛卵巢靜止的治療[J];甘肅畜牧獸醫(yī);1994年04期

6 韓學(xué)義;徐大文;;淺議奶牛產(chǎn)后卵巢靜止及萎縮的治療[J];科學(xué)種養(yǎng);2011年10期

7 康曉冬;吳韶儒;范春梅;;奶牛產(chǎn)后卵巢靜止的診斷與治療[J];黃牛雜志;2005年06期

8 張江;肖鑫煥;王剛;夏成;舒適;白云龍;范子玲;吳凌;;血液能量平衡指標(biāo)對高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后卵巢靜止的影響[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2018年02期

9 張成勇;;奶牛卵巢靜止的診治[J];當(dāng)代畜牧;2017年14期

10 齊長明,侯引緒,謝慧勝,陳家璞,張彩橋,陸剛;電針和水針對奶牛卵巢靜止所致不孕效果的比較研究[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;1999年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張?zhí)於?李俊松;陳亮;;GnRH對治療奶牛卵巢靜止的效果分析[A];中國奶業(yè)協(xié)會第24次繁殖學(xué)術(shù)年會暨國家奶牛/肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系第一屆全國牛病防治學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

2 程洋子;許澳;卜淑敏;;跑臺運(yùn)動和全身垂直振動對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠子宮和骨組織VEGF蛋白表達(dá)的影響[A];中國生理學(xué)會第24屆全國會員代表大會暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2014年

3 文思敏;卜淑敏;;不同干預(yù)手段防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松機(jī)制的研究[A];中國生理學(xué)會張錫鈞基金第十三屆全國青年優(yōu)秀生理學(xué)學(xué)術(shù)論文綜合摘要、中國生理學(xué)會第十一屆全國青年生理學(xué)工作者學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2015年

4 劉賢俠;王漢魁;胡路鋒;姜志濤;李明;王建梅;楊恒;谷新利;高樹;孫延鳴;;荷斯坦牛四大主要卵巢疾病的B超輔助診斷[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)影像技術(shù)學(xué)分會第七次全體會員代表大會暨第十四次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2014年

5 王春江;康慧君;;規(guī)模化牧場常見奶牛繁殖疾病的防治[A];第二屆中國奶業(yè)大會論文集(上冊)[C];2011年

6 楊楠;文思敏;卜淑敏;;全身垂直振動對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響[A];2014年中國運(yùn)動生理生化學(xué)術(shù)會議論文集[C];2014年

7 鄧干臻;曹伯;冉洋;李成業(yè);郭玉紅;袁作章;李明建;;奶牛卵巢異常的超聲形態(tài)學(xué)檢查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)影像技術(shù)學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

8 范星星;卜淑敏;;運(yùn)動和節(jié)食干預(yù)對去卵巢大鼠血脂水平的影響[A];第四屆（2016）全國運(yùn)動生理與生物化學(xué)學(xué)術(shù)會議——運(yùn)動·體質(zhì)·健康論文摘要匯編[C];2016年

9 嚴(yán)作廷;王東升;張世棟;董書偉;苗小樓;朱新榮;韓吉清;王雪酈;;藿芪灌注液治療奶牛卵巢靜止和持久黃體臨床擴(kuò)大試驗[A];第七屆中國畜牧科技論壇論文集[C];2016年

10 徐靜;郭宏軍;;中藥組方“暖宮散”、“氣血通”治療奶牛卵巢性不孕癥試驗[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會中獸醫(yī)學(xué)分會2013年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2013年

相關(guān)重要報紙文章 前1條

1 ;促黃體素釋放激素A_2[N];河南科技報;2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 舒適;奶牛卵巢靜止血液蛋白標(biāo)識物的篩選及其預(yù)警體系的建立[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2018年

2 胡元亮;中藥治療母畜某些不孕癥及其機(jī)理研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);1999年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 范子玲;基于~1H-NMR技術(shù)的產(chǎn)后卵巢靜止奶牛乳清代謝譜分析[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2018年

2 趙榮;中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動對去卵巢大鼠骨密度、骨生物力學(xué)指標(biāo)及骨組織VEGF蛋白表達(dá)的影響[D];首都體育學(xué)院;2012年

3 文思敏;全身垂直振動對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織微結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度的影響[D];首都體育學(xué)院;2014年

4 謝金珍;跑臺運(yùn)動訓(xùn)練和停訓(xùn)對去卵巢大鼠血清性激素、骨密度和骨微結(jié)構(gòu)的影響[D];首都體育學(xué)院;2011年

5 王海濱;安格斯牛主要卵巢疾病的調(diào)查、B超診斷及其中藥治療的研究[D];石河子大學(xué);2016年

6 孫雨航;基于~1H NMR技術(shù)的卵巢靜止奶牛血漿代謝譜分析[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2015年

7 王穎捷;中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動減緩去卵巢大鼠腰椎骨量丟失機(jī)制的研究[D];首都體育學(xué)院;2010年

8 錢偉東;高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后主要卵巢疾病的調(diào)查和血液臨床病理學(xué)變化及其預(yù)警評估[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2016年

9 張顥;中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動對去卵巢大鼠骨密度及部分血清相關(guān)指標(biāo)的影響[D];首都體育學(xué)院;2009年

10 富宏騫;中藥治療奶牛卵巢靜止的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

本文編號：2670674