【摘要】：在生物體中,蛋白質(zhì)的同源二聚結(jié)構(gòu)是一種普遍存在的現(xiàn)象。將兩種具有同源二聚結(jié)構(gòu)的蛋白融合后可形成具有線(xiàn)性結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的同源多聚體。該同源多聚體應(yīng)用范圍廣泛,其中便可作為呈遞抗原蛋白的疫苗平臺(tái),通過(guò)插入不同的抗原表位,提高抗原載量,刺激機(jī)體產(chǎn)生更好的免疫保護(hù)效果。本研究中以該同源多聚體疫苗平臺(tái)為思路,應(yīng)用基因工程技術(shù)將擴(kuò)增的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的動(dòng)力蛋白輕鏈8a(EtDLC8a)基因克隆到含有谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的PGEX-6P-1載體上,構(gòu)建了EtDLC8a-GST疫苗平臺(tái)。經(jīng)Native-PAGE和Western blot驗(yàn)證構(gòu)建的EtDLC8a-GST可形成多聚體。選取EtDLC8a基因中非結(jié)構(gòu)區(qū)域作為抗原片段插入位點(diǎn),對(duì)EtDLC8a-GST疫苗平臺(tái)進(jìn)一步改造完善。同時(shí),選取柔嫩艾美耳球蟲(chóng)抗原MIC2部分抗原片段,插入到疫苗平臺(tái)中,構(gòu)建了EtDLC8a-GST-MIC2多聚蛋白復(fù)合體疫苗,并對(duì)該多聚蛋白復(fù)合體疫苗進(jìn)行了保護(hù)性評(píng)價(jià)。通過(guò)Native-PAGE和Western-Blot技術(shù)分析表明,選取構(gòu)建的外源片段插入位點(diǎn)不會(huì)影響EtDLC8a-GST疫苗平臺(tái)形成的多聚結(jié)構(gòu),同時(shí)將抗原片段EtMIC2插入疫苗平臺(tái)后對(duì)多聚結(jié)構(gòu)的形成不會(huì)造成影響。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)重組疫苗進(jìn)行了免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)。將210只一日齡海蘭褐公雛雞隨機(jī)分7組,即不免疫不感染組(I組)、不免疫感染組(II組)、EtMIC2抗原片段免疫組(III組)、TgDLC8a-GST免疫組(IV組)、EtDLC8a-GST免疫組(V組)、TgDLC8a-GST-MIC2免疫組(VI組)和EtDLC8a-GST-MIC2免疫組(VII組)。對(duì)雛雞進(jìn)行7日齡初免,14日齡二免,在21日齡時(shí)除不免疫不感染組(I組)外其余組均進(jìn)行攻蟲(chóng)感染。通過(guò)體重增長(zhǎng)、盲腸病變、卵囊排出量、淋巴因子水平、血清及粘膜抗體水平等對(duì)免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明,EtMIC2抗原片段免疫組(III組)(ACI=92.70)與對(duì)照組比較,部分抗原片段所提供的免疫保護(hù)力相對(duì)較弱。TgDLC8a-GST-MIC2免疫組(VI組)(ACI=137.00)和EtDLC8a-GST-MIC2免疫組(VII組)(ACI=136.44)與EtMIC2抗原片段免疫組(III組)(ACI=92.70)比較說(shuō)明,多聚復(fù)合物提供的免疫保護(hù)效果優(yōu)于蛋白單體(ACI評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):ACI120為無(wú)效,120ACI160為中等有效,160ACI180為良好,ACI180為優(yōu)秀)。血清抗體與粘膜抗體水平結(jié)果表明,EtMIC2抗原片段免疫組(III組)、TgDLC8a-GST-MIC2免疫組(VI組)和EtDLC8a-GST-MIC2免疫組(VII組)與對(duì)照組相比差異顯著(P0.05)。TgDLC8a-GST-MIC2免疫組(VI組)和EtDLC8a-GST-MIC2免疫組(VII組)與EtMIC2抗原片段免疫組(III組)相比差異顯著(P0.05)。在細(xì)胞因子水平方面,TgDLC8a-GST-MIC2免疫組(VI組)和EtDLC8a-GST-MIC2免疫組(VII組)與EtMIC2抗原片段免疫組(III組)相比,具有顯著性差異(P0.05)。另外,淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果表明,在CD4~+與CD8~+T淋巴細(xì)胞亞群水平,TgDLC8a-GST-MIC2免疫組(VI組)和EtDLC8a-GST-MIC2免疫組(VII組)與EtMIC2抗原片段免疫組(III組)相比,具有顯著性差異(P0.05)。綜上,應(yīng)用多聚體疫苗平臺(tái)可提升部分抗原的免疫保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1 LC8 的二聚體結(jié)構(gòu)Figure 1 Dimer structure of LC899）球蟲(chóng)病嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的一種呈全球流行的腸道寄生蟲(chóng)病，主要全世界造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá) 30 億美元（Dalloul et al., 20轉(zhuǎn)化效率，，導(dǎo)致生產(chǎn)性能的下降。目前，對(duì)于雞球蟲(chóng)病是，長(zhǎng)期、大量的藥物應(yīng)用，嚴(yán)重導(dǎo)致耐藥蟲(chóng)株的出現(xiàn)之食品安全性要求愈加嚴(yán)格，藥物防控已經(jīng)不再適用于球蟲(chóng)防治方法迫切需要。疫苗防控解決的藥物防控造成相應(yīng)的一些缺點(diǎn)。強(qiáng)毒苗和弱毒苗的使用可以在一定程毒苗具有致病性，需要嚴(yán)格的操作，否則便會(huì)引起球蟲(chóng)病的毒苗的制備需要大量的球蟲(chóng)卵囊，并且毒力會(huì)出現(xiàn)反復(fù)的

將上述誘導(dǎo)的 EtDLC8a-GST-MIC2 蛋白處理后，經(jīng)全式金 ProteinIso GST Res的蛋白，純化后的目的蛋白與-80℃保存，處理與純化步驟參考 2.2.2.11。通過(guò) Native-PAGE 和 Western blot 對(duì)純化后的 EtDLC8a-GST-MIC2 蛋白進(jìn)行結(jié)詳細(xì)步驟參考 2.2.2.12。.5 EtDLC8a-GST-MIC2 與 TgDLC8a-GST-MIC2 免疫效果的對(duì)比.5.1 疫苗的制備取出-80℃保存純化后的蛋白，將蛋白用PBS稀釋至1mg/mL，按照每只雞免疫1計(jì)算所需的蛋白總量，吸取相應(yīng)量的溶液，加入PBS混勻備用，4℃保存?zhèn)溆谩?5.2 免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)與免疫程序購(gòu)置 1 日齡海蘭褐公雛雞稱(chēng)重，剔除群內(nèi)個(gè)體差異較大的雛雞，將 210 只雛雞，做好標(biāo)記，對(duì)照組每只雞頸部皮下注射 100μL PBS，免疫組每只雞頸部皮下μg 蛋白。分組和免疫情況如下：
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2670206