【摘要】：原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)作為精子和卵子的祖細胞,對物種的延續(xù)和繁衍具有重要作用,并且PGCs為發(fā)育生物學研究、移植治療、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)等方面提供了巨大的便利。然而,如何迅速有效地獲取大量PGCs來滿足研究和生產(chǎn)實際的需要,是突顯在人們面前的問題。為此,研究者們致力于體外誘導分化為PGCs的研究,試圖使得PGCs能源源不斷地通過體外分化產(chǎn)生,但由于PGCs誘導分化效率低,誘導細胞技術體系不成熟,難以獲得大量PGCs,其關鍵在于不完全清楚哪些因素能影響PGCs的形成,所以亟需建立健全PGCs發(fā)生的具體機制。長期以來,人們對PGCs形成的具體調(diào)控機制的研究主要局限于遺傳學因素包括信號通路和關鍵基因的研究上,然而隨著理論發(fā)展和技術手段的不斷深入,研究人員更加清晰地認識到生殖干細胞發(fā)育過程是一個極其精密而復雜的調(diào)控過程,除了遺傳學因素,研究者們還發(fā)現(xiàn)PGCs的形成離不開細胞特異性的組蛋白甲基化修飾。所以,從表觀遺傳修飾的角度探索組蛋白甲基化如何聯(lián)系遺傳學參與PGCs命運決定過程,將有助于人們更加全面地揭示PGCs的發(fā)生。為此,本研究基于本課題組前期對雞胚胎干細胞(Embryonic stem cell,ESCs)、PGCs和精原干細胞(Spermatogonial stem cel1s,SSCs)三種細胞進行的全基因組RNA-seq和H3K4me2的ChIP-seq結(jié)果,以調(diào)控PGCs形成的關鍵信號通路和組蛋白H3K4me2修飾為切入點,對RNA-seq篩選的候選信號通路和ChIP-seq富集的關鍵信號通路進行聯(lián)合分析,從中篩選出參與PGCs形成的關鍵信號通路—Wnt信號。利用分子生物學方法探索組蛋白甲基化修飾如何協(xié)同信號通路調(diào)節(jié)PGCs形成相關基因表達進而影響PGCs形成。該研究為弄清PGCs形成的機制提供理論依據(jù),并為后續(xù)深入研究其表觀遺傳調(diào)控機制奠定基礎。研究結(jié)果如下:(1)H3K4me2 通過 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2 信號鏈調(diào)控 PGCs 形成的研究對 ESCs、PGCs和SSCs三種細胞的RNA-seq和ChIP-seq結(jié)果進行聯(lián)合分析,確認PGCs發(fā)生過程中受H3K4me2調(diào)控的關鍵信號通路—Wnt信號通路及其關鍵信號分子Wnt5A、β-Catenin和TCF7L2。通過體內(nèi)外實驗在RNA水平和蛋白水平上驗證PGCs形成過程中Wnt5a介導Wnt5a/β-Catenin/Tcf712信號鏈的激活,并成功構(gòu)建了 Myc標記的Tcf712融合表達載體,通過免疫共沉淀實驗驗證了雞β-Catenin和TCF7L2蛋白之間的互作關系,從而確定了雞PGCs形成過程中Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信號鏈的存在,為后續(xù)探究具體調(diào)控PGCs形成的機制做鋪墊。通過ChIP-qPCR在ESCs和PGCs兩種細胞中驗證了 H3K4me2在Wnt5A啟動子區(qū)存在 2 個富集位點(P1:3.072±0.513 和 17.3±1.924；P2:2.40±0.094 和 9.97±0.625)、在β-Catenin 啟動子區(qū)存在 4 個富集位點(P1:7.41±0.413 和 12.23±1.952;P2:2.23±0.155 和11.54±1.602;P3:4.19±0.516 和 7.75±0.619;P4:5.61±0.641 和 9.68±0.547)、在 TCF7L2 啟動子區(qū)存在 2 個富集位點(P1:3.02±0.032 和 15.8±1.63;P2:5.9±0.413 和 8.59±0.31),且 H3K4me2修飾在PGCs上的富集水平顯著高于ESCs(P00.5),進一步研究發(fā)現(xiàn)LSD1和MLL2能夠介導Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2啟動子區(qū)發(fā)生差異性H3K4me2富集。以上結(jié)果在RNA水平和蛋白水平上驗證了 H3K4me2正向調(diào)節(jié)Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信號傳導,為深入探究組蛋白如何介導信號通路參與PGCs的調(diào)控研究奠定基礎。(2)H3K4me2協(xié)同Wnt信號調(diào)節(jié)Lin28A/B促進PGCs形成通過生物信息學分析對Wnt信號下游TCF7L2轉(zhuǎn)錄因子的靶基因進行預測,并根據(jù)GO功能注釋篩選其中參與生殖細胞發(fā)育及干細胞分化的高度保守的靶基因Lin28A和Lin28B;體內(nèi)外實驗證實Wnt5A/β-Catenin信號和組蛋白H3K4me2能夠正向促進Lin28A和Lin28B的轉(zhuǎn)錄。成功構(gòu)建了重組表達載體pEGFP-Lin28A/B,以此確定長片段具有啟動活性;同時成功構(gòu)建缺失載體PGL3-Lin28A/B,并確定Lin28A啟動子核心調(diào)控區(qū)域為-584~+100bp和Lin28B啟動子核心區(qū)域為-1431bp~-1034bp;進一步分析發(fā)現(xiàn),Lin28A/B核心啟動子核心區(qū)存在TCF7L2結(jié)合位點,將結(jié)合位點突變發(fā)現(xiàn)Lin28A/B啟動子核心區(qū)域的活性幾乎完全喪失。接下來,通過雙熒光素報告基因檢測系統(tǒng)證實Lin28A和Lin28B核心啟動子區(qū)能夠響應Wnt信號;通過ChIP-qPCR在PGCs中驗證了 β-Catenin在Lin28A啟動子區(qū)存在2個富集位點(P1:26.52±2.14;P2:8.32土 1.20),在 Lin28B 啟動子區(qū)存在 3 個富集位點(P1:9.33土0.88；P2:4.90±0.53;P3:1.20土0.23),且β-Catenin水平變化能夠差異性富集Lin28A/B啟動子區(qū),以上實驗確定Lin28A/B是Wnt信號的直接靶基因。成功構(gòu)建Lin28A/B過表達載體和干擾載體,并通過體內(nèi)外實驗探究Lin28A/B對PGCs形成的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在過表達組誘導第4d出現(xiàn)類胚體,第6d類胚體數(shù)量變多,并且同時過表達Lin28A和Lin28B誘導第2天便開始出現(xiàn)較大的EB,第4d類胚體數(shù)量變大變多,第6d類胚體出現(xiàn)大量的細胞分裂,與 0d(1±0)相比,第 6d PGCs 標記基因 Cvh、C-kit 和 Blimp1 顯著上升至 1.61±0.07、2.21±0.07和3.08±0.09(P0.05),干擾組在同樣的條件下則不能。體內(nèi)對經(jīng)Lin28A/B不同處理孵化至4.5d的雞胚生殖嵴進行qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果。流式細胞分析發(fā)現(xiàn)相較BMP4和BMP4+NC(3.31%±0.37和4.21%±0.21)組,體外同時過表達Lin28A/B顯示較高的CVH陽性率(5.86%±0.35),而同時敲低Lin28A/B,CVH陽性率(1.91%±0.02)極顯著下調(diào)(P0.01);體內(nèi)流式細胞分析結(jié)果出現(xiàn)類似表達趨勢:與Blank和NC(54.7%±3.12和52.6%±2.18)組相比,同時過表達Lin28A/B顯示較高的CVH 陽性率(66.7%±4.31),而同時敲低Lin28A/B,CVH陽性率(37.1%±1.97)極顯著下調(diào)(P0.01)。以上結(jié)果表明Lin28是受H3K4me2和Wnt信號調(diào)控的直接靶基因,且Lin28能正向調(diào)控PGCs的形成。(3)β-catenin與LSD1競爭結(jié)合TCF7L2促進Lin28A/B的轉(zhuǎn)錄通過ChIP-qPCR驗證H3K4me2在Lin28A核心啟動子區(qū)TCF7L2結(jié)合元件附近存在2個富集位點(P1:14.96±1.41;P2:11.74±1.41),在Lin28B核心啟動子區(qū)TCF7L2結(jié)合元件附近存在2個富集位點(P1:3.08±0.041;P2:6.39±0.522),且 MLL2 和 LSD1 能夠介導 Lin28A/B 啟動子區(qū) H3K4me2的差異富集;雙熒光素報告基因檢測發(fā)現(xiàn)H3K4me2甲基化能增強Lin28A/B啟動子區(qū)對Wnt信號的響應,而H3K4me2去甲基化則降低Lin28A/B啟動子區(qū)對Wnt信號的響應。成功構(gòu)建LSD1-flag融合表達載體,并將LSD 1分別與TCF7L2和β-Catenin進行共轉(zhuǎn)染DF1細胞,COIP驗證發(fā)現(xiàn)LSD1能夠與TCF7L2蛋白結(jié)合而不是β-Catenin蛋白,進一步將LSD1、TCF7L2和β-Catenin以不同組合形式轉(zhuǎn)染DF1細胞,COIP檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin能夠與LSD1競爭結(jié)合TCF7L2。以上實驗結(jié)果表明β-catenin能夠與LSD1競爭結(jié)合TCF7L2促進Lin28A/B的轉(zhuǎn)錄,解除LSD1對靶基因Lin28啟動子區(qū)的H3K4me2去甲基化作用,激活Lin28表達。(4)Lin28A/B通過抑制gga-let7a-3p促進PGCs形成標記基因Blimp1的轉(zhuǎn)錄在線軟件預測篩選了 micRNA-let7 家族 17 個雞的 micRNA-let7s 成熟體(gga-let7s),在 ESCs、PGCs和DF1三種細胞中進行同時干擾或過表達Lin28A/B處理,通過qRT-PCR篩選處關鍵候選的micRNA,即gga-let-7a-2-3p。進一步預測發(fā)現(xiàn)gga-let7a-3p共有558個靶基因,根據(jù)Target Score由高到低對靶基因進行篩選,發(fā)現(xiàn)調(diào)控PGCs形成的關鍵標記基因Blimp1。對Blimpl 3'UTR區(qū)域的gga-let7a-3p三個結(jié)合位點進行全部缺失,成功構(gòu)建了 Blimp1 3'UTR野生型和突變型載體,即Blimp1-3'UTR-WT和Blimp1-3'UTR-Mut;通過雙熒光素酶報告基因檢測驗證gga-let-7a能夠結(jié)合到Blimp1的3'UTR區(qū)域抑制其表達。以上結(jié)果表明Lin28A/B可能通過抑制gga-let7a-3p促進Blimp1的轉(zhuǎn)錄進而調(diào)控PGCs形成。
【圖文】：

在抑制ＰＧＣｓ的譜系特異性分化中起作用。此外，Ｄａｕｊａｔ等在著絲點周圍的異染色質(zhì)發(fā)逡逑現(xiàn)了邋Ｈ３Ｋ６４ｍｅ３修飾，，而這種修飾在ＰＧＣｓ發(fā)育的Ｅ９．５？１２．０階段持續(xù)表達，但是在逡逑Ｅ１２．０￣Ｅ１３．５階段出現(xiàn)瞬時擦除。（圖１－１）。逡逑－邐Ｂ邋＇！灥Ｎ邋Ｄ．逡逑ｉＭｉＨ邋￣邐ｎ．ｄ逡逑ｎｄ逡逑ｍｍａｍｍ邋？邐■■■■逡逑邐邐U蜽漏Ｂ邐Ｎ．Ｄ．邋ｐｉｌｌｌｌ逡逑邐逡逑Ｅ６．５邐Ｅ７．５邐Ｅ８．５邐Ｅ９．５邐Ｅ１０５邐Ｅ１１．５邐Ｅ１２．５邐Ｅ１３．５逡逑ｌ邋特化邋｜邋｜邐遷移邐＿１｜邐定居生殖螬邐１逡逑生殖

本文編號：2670231