發(fā)布時(shí)間：2020-05-17 15:31

【摘要】：MicroRNAs是一類在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛表達(dá)的微小RNA分子,是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要因子,通常在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮其調(diào)控作用。它能夠通過識(shí)別并特異性結(jié)合其靶基因的3'-UTR來阻斷翻譯過程或者降解mRNA,從而實(shí)現(xiàn)調(diào)控作用。PPARs屬于配體誘導(dǎo)核受體,在細(xì)胞內(nèi)廣泛參與許多代謝途徑。PPAR-γ是其中的一員,是重要的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,又與脂質(zhì)代謝有著密不可分的關(guān)系。PPAR-γ基因是奶牛乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯合成基因網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵一環(huán),其表達(dá)水平與細(xì)胞的甘油三酯合成量呈正相關(guān),且甘油三酯是乳脂的主要成分。因此,PPAR-γ基因被我們選定為重點(diǎn)關(guān)注的靶基因。使用TargetScan預(yù)測(cè)可能靶向作用于PPAR-γ基因的miRNAs,共預(yù)測(cè)出69個(gè)可能靶向作用于PPAR-γ基因的miRNA。除去已證實(shí)存在靶向調(diào)控關(guān)系的miRNA,結(jié)合評(píng)分,我們選取了miR-454與miR-27b作為候選miRNAs。利用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)miRNA和靶基因的互作關(guān)系。將牛的PPAR-γ基因的mRNA的全長3'UTR區(qū)克隆到雙熒光素酶載體中的XhoI和NotI位點(diǎn)之間,產(chǎn)物長度為118bp。以TargetScan預(yù)測(cè)的miR-454和miR-27b的結(jié)合位點(diǎn)為依據(jù)構(gòu)建突變型載體:突變I型載體(bos-PPARG MUT1)突變?yōu)?AACGTGA,突變II型載體(bos-PPARG MUT1)突變?yōu)?TGACACT。載體構(gòu)建完成后,將其與miRNA mimics共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。雙熒光素酶活性報(bào)告顯示,與對(duì)照組相比,miR-454的過表達(dá)使雙熒光活性降低超過40%,顯著低于對(duì)照組的熒光活性(p0.05)。隨著其預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的突變,miR-454的過表達(dá)使293T細(xì)胞中的熒光素酶活性顯著增加且與對(duì)照組(NC)相比無明顯變化(p0.05);然而,與NC組相比,miR-27b的過表達(dá)使熒光活性下降不超過30%。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,miR-454能直接結(jié)合PPAR-γ基因的3'UTR,表明miR-454可以調(diào)控PPAR-γ基因的表達(dá),而miR-27b則無法通過預(yù)測(cè)位點(diǎn)靶向調(diào)控PPAR-γ基因的表達(dá)。為進(jìn)一步探究miR-454對(duì)PPAR-γ基因的調(diào)控作用模式,將miR-454 mimics和miR-454 inhibitor轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。熒光定量PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-454 mimics48h后,與對(duì)照組相比miR-454的表達(dá)量顯著上升(p0.05);而轉(zhuǎn)染miR-454inhibitor后,與對(duì)照組相比miR-454的表達(dá)量顯著下降(p0.05)。結(jié)果表明成功過表達(dá)或干擾奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的miR-454。對(duì)目的基因的熒光定量PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-454 mimics 48h后,與NC組相比PPAR-γ基因的mRNA表達(dá)水平顯著下降(p0.05),而轉(zhuǎn)染了miR-454 inhibitor后,與I-NC相比PPAR-γ基因的mRNA表達(dá)水平顯著上升(p0.05)。結(jié)果表明通過對(duì)miR-454的過表達(dá),PPAR-γ基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低,而干擾miR-454的表達(dá),使PPAR-γ基因的mRNA表達(dá)水平顯著上升。對(duì)Western Blot的顯影圖像結(jié)果進(jìn)行灰度分析,結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-454 mimics 48h后,與NC組相比轉(zhuǎn)染miR-454 mimics使PPAR-γ基因的蛋白表達(dá)水平顯著下降(p0.05),而與I-NC相比轉(zhuǎn)染miR-454inhibitor使PPAR-γ基因的蛋白表達(dá)水平顯著上升(p0.05)。結(jié)果表明通過對(duì)miR-454的過表達(dá),PPAR-γ基因的蛋白表達(dá)水平顯著降低;而干擾miR-454的表達(dá),PPAR-γ基因的蛋白表達(dá)水平顯著上升。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了miR-454靶向作用于PPAR-γ基因,并有可能通過調(diào)控PPAR-γ基因的表達(dá)量影響甘油三酯合成。為了探究miR-454對(duì)甘油三酯合成的影響,將轉(zhuǎn)染48 h后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色和細(xì)胞總甘油三酯測(cè)定。結(jié)果觀察到過表達(dá)miR-454降低了脂滴的積累和甘油三酯的產(chǎn)生;而miR-454的抑制出現(xiàn)了相反的結(jié)果。因此,證實(shí)了miR-454可通過調(diào)控PPAR-γ基因的表達(dá)水平來影響乳脂合成。對(duì)PPAR-γ基因的下游基因的研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-454 mimics 48 h后,與NC組相比FABP3基因和PLIN2基因的mRNA表達(dá)水平顯著下降(p0.05),而轉(zhuǎn)染miR-454 inhibitor后,與I-NC相比FABP3基因和PLIN2基因的mRNA表達(dá)水平顯著上升(p0.05)。miR-454的過表達(dá)和干擾還能影響PPAR-γ基因下游的FABP3基因和PLIN2基因的mRNA表達(dá)水平,從而參與甘油三酯的合成途徑。研究結(jié)果驗(yàn)證了miR-454是PPAR-γ基因的調(diào)控因子,miR-454能夠通過調(diào)控PPAR-γ基因及下游基因的表達(dá)來影響甘油三酯的合成。本研究結(jié)果為優(yōu)良品系奶牛選育提供了理論依據(jù),也為乳脂代謝過程的研究提供了新的思路。
【圖文】：

第一篇 文獻(xiàn)綜述 第一章 MicroRNA 及其功能莖的兩條鏈，得到長度為 60~70nt 的具有發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 miRNA 前體（miRNAprecursor，，pre-miRNA）。Pre-miRNA 的 5’端磷酸化且 3’端具有~2nt 的突出結(jié)構(gòu)[9,10]。Pre-miRNA 在核輸出因子 exportin-5 和 Ran-GTP 的相互作用下從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中[11,12]。核酸內(nèi)切酶 RNase III Dicer 進(jìn)一步推進(jìn) pre-miRNA 的成熟進(jìn)程。Dicer 酶與 pre-miRNA 的莖環(huán)基部 5’磷酸端和 3’端的突出部分具有特殊的親和力，其與雙鏈 RNA 結(jié)合蛋白（TRBP）共同加工 pre-miRNA，將 pre-miRNA的莖環(huán)部分切除，形成長度為 18-22nt 的雙鏈 miRNA[13-15]。最后，雙鏈 miRNA被轉(zhuǎn)載進(jìn)入 AGO2，形成 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedSilencingComplex,RISC）。雙鏈 miRNA 的其中一條鏈（引導(dǎo)鏈）保存在 RISC 中，即成熟的 miRNA，另一條鏈（又稱為過客鏈）迅速降解[16,17]。

PPAR-γ具有多種活性Fig.2.1PPAR-γhasmultipleactivities
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S823

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