【摘要】：豬是肉類蛋白的主要來(lái)源,同時(shí),也可作為研究人類健康問(wèn)題的重要醫(yī)學(xué)模型。骨骼肌是動(dòng)物體內(nèi)最豐富的組織,因此研究豬骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)肉質(zhì)生產(chǎn)科學(xué)和人類醫(yī)學(xué)都具有重大意義。本研究以生長(zhǎng)速度和肉質(zhì)性狀存在顯著差異的約克夏豬和通城豬作為研究對(duì)象,采用RNA-seq技術(shù),探索了妊娠期40,55,63,70和90天兩豬種胚胎背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因不同的時(shí)序性表達(dá)規(guī)律,推測(cè)了兩豬種間肌纖維發(fā)育差異的時(shí)間拐點(diǎn),在此基礎(chǔ)上探究中外豬種在妊娠時(shí)期胚胎骨骼肌發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理;使用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序(WGBS)技術(shù),檢測(cè)了妊娠期55天兩豬種胚胎背最長(zhǎng)肌的差異甲基化圖譜,分析了兩豬種差異DNA甲基化對(duì)肌纖維發(fā)育的調(diào)控;并對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)和全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了聯(lián)合分析,分析了DNA甲基化對(duì)兩豬種肌纖維發(fā)育過(guò)程中差異表達(dá)基因的調(diào)控作用,主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1.利用RNA-seq技術(shù)獲得了通城豬和約克夏豬妊娠5個(gè)時(shí)期的胚胎背最長(zhǎng)肌的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜,并利用熒光定量PCR驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果的可靠性。在通城豬和約克夏豬分別篩選到1317個(gè)和691個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)。使用STEM(Short Time-series Expression Miner)分別對(duì)上述通城豬和約克夏豬的發(fā)育依賴的DEGs進(jìn)行時(shí)序性分析,發(fā)現(xiàn)了在兩個(gè)豬種中都顯著富集到的表達(dá)模式0,39,20和21,表達(dá)模式10,11,13和25只在通城豬中顯著富集,表達(dá)模式14和15只在約克夏豬中顯著富集。分別對(duì)通城豬和約克夏豬的差異基因進(jìn)行GO和KEGG通路功能注釋及富集分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩豬種共同表達(dá)模式39顯著富集的GO條目中均發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的GO條目;共同表達(dá)模式0顯著富集的GO條目中均發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的GO條目。通路富集分析結(jié)果顯示,通城豬和約克夏豬差異表達(dá)基因富集的前10條通路中有8條是兩豬種共同富集到的,但富集程度不同。這些結(jié)果說(shuō)明妊娠時(shí)期胚胎的背最長(zhǎng)肌的發(fā)育機(jī)制在兩豬種中有相似之處,又存在一定的差異。2.對(duì)兩個(gè)豬種分別在5個(gè)時(shí)期的基因表達(dá)進(jìn)行差異比較分析,總共獲得了1677個(gè)差異表達(dá)基因。5個(gè)比較組中,妊娠55天的差異表達(dá)基因最多。對(duì)兩個(gè)豬種間的差異基因進(jìn)行GO和KEGG通路功能注釋及富集分析,發(fā)現(xiàn)黏著斑(Focal adhesion),細(xì)胞外基質(zhì)受體互作(ECM-receptor interaction),氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等8條顯著富集的通路。然后,對(duì)兩豬種間差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)PTEN,EP300,MYO9A,CDK14,IRS1,PPP1CC和一些核糖體蛋白基因可能對(duì)揭示兩豬種胚胎肌肉發(fā)育差異有重要作用。3.通過(guò)ASprofile軟件分析,發(fā)現(xiàn)第一個(gè)外顯子可變剪切(TSS)和最后一個(gè)外顯子可變剪切(TTS)事件是兩豬種中最主要的可變剪切類型。4.本研究通過(guò)WGBS技術(shù)構(gòu)建了通城豬和約克夏豬在妊娠55天時(shí)胚胎背最長(zhǎng)肌全基因組DNA甲基化圖譜,并揭示了其DNA甲基化特征:CG雙核苷酸甲基化是兩豬種基因組DNA甲基化的主要方式,只有極少部分DNA甲基化發(fā)生在CHH和CHG序列上;不同功能元件的甲基化水平分析中,CG位點(diǎn)甲基化水平在內(nèi)含子和3?UTR中的DNA甲基化水平較高,而非CG位點(diǎn)甲基化水平在CGI區(qū)域最高。5.通過(guò)WGBS技術(shù),通城豬和約克夏豬之間獲得了211822個(gè)差異甲基化區(qū)域(DMR),涉及到了12261個(gè)差異甲基化基因(DMG),其中在通城豬中差異高甲基化的有36582個(gè)DMR,涉及到DMG個(gè)數(shù)為5301;在約克夏豬中差異高甲基化的DMR為175240個(gè),涉及到DMG為11746個(gè)。對(duì)兩豬種的DMGs進(jìn)行GO和KEGG通路功能注釋和富集分析,發(fā)現(xiàn)在CG、CHG、GHH三種不同序列環(huán)境下的DMGs都顯著富集到多個(gè)GO條目;KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)非CG序列環(huán)境下的DMGs均顯著富集到多條通路,而CG序列環(huán)境下的DMGs只顯著富集到磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)(Phosphatidylinositol signaling system)。通過(guò)WGBS技術(shù),鑒定到啟動(dòng)子區(qū)域的DMR為5946個(gè),涉及到DMG為4578個(gè)。對(duì)啟動(dòng)子區(qū)DMGs進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析,發(fā)現(xiàn)只有CHH序列背景下的DMGs顯著富集到了GO條目,但是在三種序列背景下的DMGs主要富集到的GO條目中有一些與肌肉發(fā)育相關(guān)GO條目;在三種序列背景下的DMGs都沒(méi)有顯著富集到通路,但主要富集的通路中都有核糖體(Ribosome),這表明核糖體通路中基因啟動(dòng)子甲基化可能會(huì)調(diào)控肌肉的發(fā)育。6.對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與全基因組甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析,通過(guò)在整體水平上分析DNA甲基化水平與基因表達(dá)水平的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)兩豬種在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2kb及基因本體靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域中DNA甲基化水平與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān);基因本體靠近轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)區(qū)域中DNA甲基化水平與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。檢測(cè)到同時(shí)是DMG又是DEG的基因個(gè)數(shù)616個(gè),對(duì)其進(jìn)行通路富集分析發(fā)現(xiàn),主要富集的通路中黏著斑,Wnt信號(hào)通路(Wnt signaling pathway),凋亡(Apoptosis-multiple species),細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用和TGF-beta信號(hào)通路(TGF-beta signaling pathway)在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。7.構(gòu)建候選基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-RPL6和pcDNA3.1(+)-TPPP3;合成RPL6和TPPP3基因的干涉片段并篩選到干涉效率最佳的干涉片段。使用免疫熒光技術(shù),檢測(cè)干涉RPL6和TPPP3基因表達(dá)后,肌管形態(tài)的變化,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)干涉組的肌管數(shù)目都明顯低于對(duì)照組,且RPL6干涉組的肌管明顯變粗。使用流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)干涉RPL6和TPPP3基因表達(dá)后,對(duì)C2C12細(xì)胞周期進(jìn)程的影響,發(fā)現(xiàn)RPL6基因參與了細(xì)胞周期的調(diào)節(jié),干涉RPL6后會(huì)使滯留于G1期的細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組,滯留于S期和G2期的細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組;發(fā)現(xiàn)干涉TPPP3后,細(xì)胞周期各階段的細(xì)胞比例與對(duì)照組相比皆無(wú)明顯差異。通過(guò)免疫熒光技術(shù)鑒定到超表達(dá)基因RPL6可以增加細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA:增殖標(biāo)志基因)蛋白的表達(dá)
【圖文】：

2-1 使用安捷倫 2100 生物分析儀檢測(cè)豬背最長(zhǎng)肌 RNA 質(zhì)uantitation of one RNA sample by Agilent Technologies 210表 2-1 使用安捷倫 2100 生物分析儀檢測(cè) RNA 質(zhì)量參數(shù) quality of RNA samples detected by Agilent Technologies 2原液濃度(ng/μL)Conc (ng/μL）總量(ug)Total amount (ug)RIN 570.0 28.5 8.4 1680.0 67.2 8.2 760.0 22.8 8.1 1550.0 38.75 7.9 1090.0 43.6 8.6 1230.0 36.9 8.0 710.0 24.85 8.3 1780.0 53.4 8.4 1130.0 33.9 8.4 288.0 10.08 8.4 2580.0 116.1 8.5 1056.0 36.96 7.6 1080.0 32.4 7.4 2130.0 106.5 7.2

q 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估與質(zhì)控格的30個(gè)RNA樣品進(jìn)行混樣（同豬種同時(shí)期的三個(gè)樣品文庫(kù)，然后高通量測(cè)序，測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)列（raw reads），結(jié)果以 FASTQ 文件格式存儲(chǔ)，其中包質(zhì)量信息。為了保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，需要在信息分析前對(duì)原據(jù)過(guò)濾等預(yù)處理。量分布檢測(cè)序文庫(kù)的堿基含量分布檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖 2-2）（以 TC4 90-100bp 位置的核苷酸組成存在一定的偏好性，這主要 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 時(shí)所用的隨機(jī)引物導(dǎo)致，而其他位置的、CG 分離現(xiàn)象，且各文庫(kù)總體堿基比例分布均勻。該結(jié)了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S828

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐三平;吳明洲;吳招甫;吳平波;杜亞球;黎旺明;王直槐;徐圣海;胡賀;;通城豬保種利用工作的進(jìn)展與展望[J];中國(guó)豬業(yè);2013年S1期

2 黎旺明;徐圣海;;通城豬的保護(hù)和利用[J];中國(guó)豬業(yè);2013年S1期

3 徐三平;彭中鎮(zhèn);;通城豬的特點(diǎn)及其保種利用[J];豬業(yè)科學(xué);2006年04期

4 徐三平,徐亮;國(guó)家級(jí)重點(diǎn)保護(hù)豬種“通城豬”的保種措施[J];湖北畜牧獸醫(yī);2002年04期

5 熊遠(yuǎn)著;彭中鎮(zhèn);張省三;鄧昌彥;吳梅芳;范春國(guó);陳順友;;湖北白豬選育研究報(bào)告(華農(nóng)部分)[J];東北養(yǎng)豬;1987年02期

6 郭芳彬,樊中念,鐘思華,李守噩;黃岡地區(qū)種畜場(chǎng)巴克夏豬經(jīng)濟(jì)類型測(cè)試初報(bào)[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);1989年05期

7 曾凡春;張桂棠;姚亞琳;楊石林;;通城豬不同飼養(yǎng)水平育肥試驗(yàn)報(bào)告[J];湖北畜牧獸醫(yī);1981年03期

8 ;湖北通城豬的特點(diǎn)及其保種和利用的經(jīng)驗(yàn)[J];湖北畜牧獸醫(yī);1982年03期

9 ;“通城豬”加工增值大[J];致富天地;2013年05期

10 徐三平,吳平波;通城豬的保種選育[J];湖北畜牧獸醫(yī);2001年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 徐三平;吳明洲;吳招甫;吳平波;杜亞球;黎旺明;王直槐;徐圣海;胡賀;;通城豬保種利用工作的進(jìn)展與展望[A];中國(guó)地方豬種保護(hù)與利用協(xié)作組第十屆年會(huì)論文集[C];2013年

2 黎旺明;徐圣海;;通城豬的保護(hù)和利用[A];中國(guó)地方豬種保護(hù)與利用協(xié)作組第十屆年會(huì)論文集[C];2013年

3 劉基偉;李奎;徐日福;任紅艷;肖邦;白立景;;通城豬ADSL基因在兩個(gè)時(shí)期不同組織中的mRNA表達(dá)分析[A];中國(guó)動(dòng)物遺傳育種研究進(jìn)展——第十五次全國(guó)動(dòng)物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2009年

4 黎旺明;徐三平;楊忠新;劉紅輝;;創(chuàng)新通城豬保種選育利用組織體系 做好開發(fā)利用文章[A];中國(guó)地方豬種保護(hù)與利用協(xié)作組第十一屆年會(huì)論文集[C];2015年

5 劉榜;;中國(guó)地方品種通城豬抗藍(lán)耳病研究進(jìn)展[A];中國(guó)地方豬種保護(hù)與利用協(xié)作組第十屆年會(huì)論文集[C];2013年

6 王恒;李新云;朱正茂;楊述林;牟玉蓮;馮書堂;李奎;;豬EPLIN基因單核苷酸多態(tài)性研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2006學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2006年

7 梁婉;劉榜;;通城豬和大白豬在PRRSV人工感染后免疫應(yīng)答的差異分析[A];中國(guó)地方豬種保護(hù)與利用協(xié)作組第十一屆年會(huì)論文集[C];2015年

8 樊斌;黃廷華;彭中鎮(zhèn);徐三平;杜亞球;徐圣海;唐中林;劉榜;李奎;;地方豬保種與利用信息管理系統(tǒng)的建立[A];全國(guó)畜禽遺傳資源保護(hù)與利用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

9 魏慶信;鄭新民;李莉;肖紅衛(wèi);;影響豬胚胎移植效率的若干因素研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物繁殖學(xué)分會(huì)第十五屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2010年

10 楊述林;王恒;任紅艷;李奎;;豬十二號(hào)染色體上多個(gè)SNP與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2006學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2006年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前4條

1 特約記者 劉健平;通城養(yǎng)豬成為農(nóng)民“聚寶盆”[N];咸寧日?qǐng)?bào);2008年

2 通訊員 劉健平;養(yǎng)豬成為通城農(nóng)民聚寶盆[N];湖北日?qǐng)?bào);2005年

3 吳志遠(yuǎn);鄂豬行天下[N];湖北日?qǐng)?bào);2010年

4 通城石南鎮(zhèn)黨委書記、鎮(zhèn)長(zhǎng) 孔慶豐;推進(jìn)村企合作 服務(wù)新農(nóng)村建設(shè)[N];咸寧日?qǐng)?bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 劉會(huì)敬;中外豬種胚胎不同發(fā)育時(shí)期骨骼肌轉(zhuǎn)錄組和全基因組甲基化分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 朱正茂;應(yīng)用cDNA宏陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬某些產(chǎn)肉性狀的候選基因[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

3 豐勝求;豬Angptl家庭基因的克隆、表達(dá)及調(diào)控研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

4 李佳;通城豬和長(zhǎng)白豬對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒耐受性差異研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 楊亞嵐;瘦肉型和脂肪型豬產(chǎn)肉性狀差異及其后代雜種優(yōu)勢(shì)形成的調(diào)控機(jī)制研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

6 伍曉雄;豬β-連環(huán)素基因的分離，，多態(tài)性檢測(cè)及其與生產(chǎn)性狀、生理生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

7 趙拴平;豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因和microRNA鑒定及其網(wǎng)絡(luò)互作分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

8 汪超;通城豬兩頭烏毛色遺傳規(guī)律研究及其全基因組選擇區(qū)域分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

9 侯欣華;骨骼肌相關(guān)miRNA的鑒定及功能分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

10 馬喜山;豬骨骼肌發(fā)育相關(guān)基因的差異表達(dá)和多態(tài)性研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 肖瑤;基因變異及其與豬繁殖與呼吸綜合征抗性相關(guān)性的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 陳星;長(zhǎng)白豬通城豬HP-PRRSV抗性差異的機(jī)制探討及利用PB構(gòu)建Marc145突變細(xì)胞庫(kù)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 王睿琪;豬肌肉生長(zhǎng)相關(guān)microRNA-1a，133b和206a的表達(dá)分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 肖啟玲;通城豬與大白豬豬肝羧酸酯酶表達(dá)譜與品種差異研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 譚林;豬CNN3和HMGCS1基因的克隆測(cè)序及其表達(dá)規(guī)律的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

6 林平;大白豬和通城豬肌纖維組織學(xué)特性差異和SH2B1、TEM18、IDH3B基因遺傳效應(yīng)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 方冬冬;通城豬和長(zhǎng)白豬肌內(nèi)脂肪含量在不同生長(zhǎng)時(shí)間的變化[D];鄭州大學(xué);2012年

8 李小平;通城豬33天和65天胚胎骨骼肌的LongSAGE分析及3個(gè)基因全長(zhǎng)cDNA的分離、定位和組織表達(dá)譜研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

9 楊亞嵐;不同品種豬骨骼肌表型差異的全基因組甲基化調(diào)控研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

10 張曉瑋;豬肌肉生長(zhǎng)抑素前肽基因定點(diǎn)誘變載體的構(gòu)建和功能初步檢測(cè)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2669036