發(fā)布時間：2020-05-17 19:10

【摘要】：豬是肉類蛋白的主要來源,同時,也可作為研究人類健康問題的重要醫(yī)學(xué)模型。骨骼肌是動物體內(nèi)最豐富的組織,因此研究豬骨骼肌的生長發(fā)育對肉質(zhì)生產(chǎn)科學(xué)和人類醫(yī)學(xué)都具有重大意義。本研究以生長速度和肉質(zhì)性狀存在顯著差異的約克夏豬和通城豬作為研究對象,采用RNA-seq技術(shù),探索了妊娠期40,55,63,70和90天兩豬種胚胎背最長肌差異表達基因不同的時序性表達規(guī)律,推測了兩豬種間肌纖維發(fā)育差異的時間拐點,在此基礎(chǔ)上探究中外豬種在妊娠時期胚胎骨骼肌發(fā)育的分子調(diào)控機理;使用全基因組重亞硫酸鹽測序(WGBS)技術(shù),檢測了妊娠期55天兩豬種胚胎背最長肌的差異甲基化圖譜,分析了兩豬種差異DNA甲基化對肌纖維發(fā)育的調(diào)控;并對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和全基因組重亞硫酸鹽測序數(shù)據(jù)進行了聯(lián)合分析,分析了DNA甲基化對兩豬種肌纖維發(fā)育過程中差異表達基因的調(diào)控作用,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.利用RNA-seq技術(shù)獲得了通城豬和約克夏豬妊娠5個時期的胚胎背最長肌的轉(zhuǎn)錄組表達譜,并利用熒光定量PCR驗證了測序結(jié)果的可靠性。在通城豬和約克夏豬分別篩選到1317個和691個差異表達基因(DEG)。使用STEM(Short Time-series Expression Miner)分別對上述通城豬和約克夏豬的發(fā)育依賴的DEGs進行時序性分析,發(fā)現(xiàn)了在兩個豬種中都顯著富集到的表達模式0,39,20和21,表達模式10,11,13和25只在通城豬中顯著富集,表達模式14和15只在約克夏豬中顯著富集。分別對通城豬和約克夏豬的差異基因進行GO和KEGG通路功能注釋及富集分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩豬種共同表達模式39顯著富集的GO條目中均發(fā)現(xiàn)了多個與肌肉生長發(fā)育相關(guān)的GO條目;共同表達模式0顯著富集的GO條目中均發(fā)現(xiàn)了多個與細胞周期相關(guān)的GO條目。通路富集分析結(jié)果顯示,通城豬和約克夏豬差異表達基因富集的前10條通路中有8條是兩豬種共同富集到的,但富集程度不同。這些結(jié)果說明妊娠時期胚胎的背最長肌的發(fā)育機制在兩豬種中有相似之處,又存在一定的差異。2.對兩個豬種分別在5個時期的基因表達進行差異比較分析,總共獲得了1677個差異表達基因。5個比較組中,妊娠55天的差異表達基因最多。對兩個豬種間的差異基因進行GO和KEGG通路功能注釋及富集分析,發(fā)現(xiàn)黏著斑(Focal adhesion),細胞外基質(zhì)受體互作(ECM-receptor interaction),氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等8條顯著富集的通路。然后,對兩豬種間差異表達基因進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)PTEN,EP300,MYO9A,CDK14,IRS1,PPP1CC和一些核糖體蛋白基因可能對揭示兩豬種胚胎肌肉發(fā)育差異有重要作用。3.通過ASprofile軟件分析,發(fā)現(xiàn)第一個外顯子可變剪切(TSS)和最后一個外顯子可變剪切(TTS)事件是兩豬種中最主要的可變剪切類型。4.本研究通過WGBS技術(shù)構(gòu)建了通城豬和約克夏豬在妊娠55天時胚胎背最長肌全基因組DNA甲基化圖譜,并揭示了其DNA甲基化特征:CG雙核苷酸甲基化是兩豬種基因組DNA甲基化的主要方式,只有極少部分DNA甲基化發(fā)生在CHH和CHG序列上;不同功能元件的甲基化水平分析中,CG位點甲基化水平在內(nèi)含子和3?UTR中的DNA甲基化水平較高,而非CG位點甲基化水平在CGI區(qū)域最高。5.通過WGBS技術(shù),通城豬和約克夏豬之間獲得了211822個差異甲基化區(qū)域(DMR),涉及到了12261個差異甲基化基因(DMG),其中在通城豬中差異高甲基化的有36582個DMR,涉及到DMG個數(shù)為5301;在約克夏豬中差異高甲基化的DMR為175240個,涉及到DMG為11746個。對兩豬種的DMGs進行GO和KEGG通路功能注釋和富集分析,發(fā)現(xiàn)在CG、CHG、GHH三種不同序列環(huán)境下的DMGs都顯著富集到多個GO條目;KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)非CG序列環(huán)境下的DMGs均顯著富集到多條通路,而CG序列環(huán)境下的DMGs只顯著富集到磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)(Phosphatidylinositol signaling system)。通過WGBS技術(shù),鑒定到啟動子區(qū)域的DMR為5946個,涉及到DMG為4578個。對啟動子區(qū)DMGs進行GO和KEGG通路富集分析,發(fā)現(xiàn)只有CHH序列背景下的DMGs顯著富集到了GO條目,但是在三種序列背景下的DMGs主要富集到的GO條目中有一些與肌肉發(fā)育相關(guān)GO條目;在三種序列背景下的DMGs都沒有顯著富集到通路,但主要富集的通路中都有核糖體(Ribosome),這表明核糖體通路中基因啟動子甲基化可能會調(diào)控肌肉的發(fā)育。6.對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)與全基因組甲基化測序數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析,通過在整體水平上分析DNA甲基化水平與基因表達水平的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)兩豬種在基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2kb及基因本體靠近轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域中DNA甲基化水平與基因表達水平呈負相關(guān);基因本體靠近轉(zhuǎn)錄終止位點區(qū)域中DNA甲基化水平與基因表達水平呈正相關(guān)。檢測到同時是DMG又是DEG的基因個數(shù)616個,對其進行通路富集分析發(fā)現(xiàn),主要富集的通路中黏著斑,Wnt信號通路(Wnt signaling pathway),凋亡(Apoptosis-multiple species),細胞外基質(zhì)受體相互作用和TGF-beta信號通路(TGF-beta signaling pathway)在肌肉生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。7.構(gòu)建候選基因真核表達載體pcDNA3.1(+)-RPL6和pcDNA3.1(+)-TPPP3;合成RPL6和TPPP3基因的干涉片段并篩選到干涉效率最佳的干涉片段。使用免疫熒光技術(shù),檢測干涉RPL6和TPPP3基因表達后,肌管形態(tài)的變化,發(fā)現(xiàn)兩個干涉組的肌管數(shù)目都明顯低于對照組,且RPL6干涉組的肌管明顯變粗。使用流式細胞術(shù),檢測干涉RPL6和TPPP3基因表達后,對C2C12細胞周期進程的影響,發(fā)現(xiàn)RPL6基因參與了細胞周期的調(diào)節(jié),干涉RPL6后會使滯留于G1期的細胞比例顯著高于對照組,滯留于S期和G2期的細胞比例顯著低于對照組;發(fā)現(xiàn)干涉TPPP3后,細胞周期各階段的細胞比例與對照組相比皆無明顯差異。通過免疫熒光技術(shù)鑒定到超表達基因RPL6可以增加細胞中增殖細胞核抗原(PCNA:增殖標(biāo)志基因)蛋白的表達
【圖文】：

2-1 使用安捷倫 2100 生物分析儀檢測豬背最長肌 RNA 質(zhì)uantitation of one RNA sample by Agilent Technologies 210表 2-1 使用安捷倫 2100 生物分析儀檢測 RNA 質(zhì)量參數(shù) quality of RNA samples detected by Agilent Technologies 2原液濃度(ng/μL)Conc (ng/μL）總量(ug)Total amount (ug)RIN 570.0 28.5 8.4 1680.0 67.2 8.2 760.0 22.8 8.1 1550.0 38.75 7.9 1090.0 43.6 8.6 1230.0 36.9 8.0 710.0 24.85 8.3 1780.0 53.4 8.4 1130.0 33.9 8.4 288.0 10.08 8.4 2580.0 116.1 8.5 1056.0 36.96 7.6 1080.0 32.4 7.4 2130.0 106.5 7.2

q 測序質(zhì)量評估與質(zhì)控格的30個RNA樣品進行混樣（同豬種同時期的三個樣品文庫，然后高通量測序，測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)列（raw reads），結(jié)果以 FASTQ 文件格式存儲，其中包質(zhì)量信息。為了保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，需要在信息分析前對原據(jù)過濾等預(yù)處理。量分布檢測序文庫的堿基含量分布檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖 2-2）（以 TC4 90-100bp 位置的核苷酸組成存在一定的偏好性，這主要 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 時所用的隨機引物導(dǎo)致，而其他位置的、CG 分離現(xiàn)象，且各文庫總體堿基比例分布均勻。該結(jié)了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S828

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本文編號：2669036