【摘要】：禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)可引起雞的良性、惡性腫瘤和亞臨床感染,導(dǎo)致雞只生長遲緩、產(chǎn)蛋下降和免疫抑制。近年來,尤其是J亞群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)在中國雞群中廣泛傳播,對雞群的安全構(gòu)成了嚴重的威脅,給我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了巨大的困擾。準種是RNA病毒在突變選擇平衡下存在的一種特殊形式,是病毒多樣性產(chǎn)生的重要原因。而ALV-J作為典型的反轉(zhuǎn)錄病毒,也存在著準種現(xiàn)象。本研究分別利用常規(guī)測序和高通量測序?qū)ξ覈鳤LV-J在地方品系雞群及個體雞只中的基因多樣性進行了系統(tǒng)分析;探究了ALV-J在不同宿主內(nèi)的演變規(guī)律;建立并探索了發(fā)生垂直傳播的ALV-J準種變異規(guī)律的動物模型;建立了ALV-J體外藥物選擇壓模型,并利用高通量測序技術(shù)對ALV-J在齊多夫定藥物選擇壓下耐藥機制進行了揭示;以上研究加深了我們對ALV-J在不同組織、細胞和藥物選擇作用下的基因多樣性的理解。1.ALV-J在同一雞群不同個體內(nèi)病毒的基因多樣性為深入了解在我國某地方品系雞中ALV-J的流行情況及其基因多樣性,我們從一個地方品系雞群不同個體中,通過病毒分離和間接免疫熒光試驗分離鑒定到10株ALV-J,分別命名為JS16JH01-JS16JH10。為進一步了解其病毒基因組的分子學(xué)特征,我們對其env-LTR基因進行常規(guī)測序,通過與參考毒株比對發(fā)現(xiàn),gp85基因同源性在89.6%-92.0%之間,U3區(qū)同源性介于88.9%-92.5%,這些分離株相互間的gp85基因同源性在92.0%-98.0%之間;同時相比參考毒株,gp85蛋白的氨基酸存在多個突變和缺失位點,其中有2個毒株在gp85上出現(xiàn)了同樣的RGQP插入突變(JS16JH01和JS16JH06),且這些毒株在進化樹上形成了一個新的分支。以上研究說明該地方雞群中仍然存在復(fù)雜的ALV-J的感染情況,且存在很大的基因多樣性,這提示我們需要將更多的注意力放在地方品系雞中ALV的凈化。2.高通量測序與常規(guī)測序在ALV-J準種研究中的應(yīng)用比較為了驗證高通量測序在研究準種時的可應(yīng)用性,我們系統(tǒng)比較了高通量測序和常規(guī)Sanger測序在準種研究中的優(yōu)缺點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2次重復(fù)試驗中高通量測序在研究準種時的準確性和重復(fù)性都要顯著優(yōu)于Sanger測序。其次在不同位點的氨基酸比例也顯示出高通量測序具有較好的穩(wěn)定性,且更準確的顯示了該位點的氨基酸構(gòu)成;而Sanger測序由于挑選克隆樣品的隨機性和數(shù)量限制導(dǎo)致位點的比例不穩(wěn)定。最后我們應(yīng)用高通量測序數(shù)據(jù)模擬常規(guī)Sanger測序在研究抗體選擇壓下準種構(gòu)成的可行性,發(fā)現(xiàn)抗體滴度越高,序列的香農(nóng)熵值越大,至少需要800條序列才能準確反映準種的構(gòu)成,而用Sanger測序的應(yīng)用可能性越小。因此,高通量測序相比常規(guī)Sanger測序更適合于準種研究。3.高通量測序研究同一只雞體不同臟器內(nèi)ALV-J基因多樣性為了更全面地研究同一只雞體不同器官內(nèi)ALV-J的基因多樣性,分別利用常規(guī)Sanger測序和Mi Seq高通量測序?qū)ζ洳煌K器的病毒RNA gp85基因的2個高變區(qū)(gp85-A和gp85-B)和LTR-U3進行測序。篩選各器官內(nèi)的前3名優(yōu)勢突變株,通過系譜進化樹和同源性比較發(fā)現(xiàn)卵泡中的病毒分別在gp85-A、gp85-B和LTR-U3演變出與其他器官內(nèi)的差異較大的優(yōu)勢突變株。在肝臟、脾臟和血漿中發(fā)現(xiàn)gp85-B段含有“LSD”3肽插入突變的優(yōu)勢突變株,但是在其他器官內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)這種突變。全局選擇壓力分析顯示卵泡和卵巢相比其他器官受到更強的選擇壓力。結(jié)合常規(guī)測序,發(fā)現(xiàn)這3段區(qū)域的最優(yōu)勢突變株均可以在同一條病毒序列中發(fā)現(xiàn),因此證明卵泡中這3段區(qū)域是共演變的。高通量測序讓我們更加清楚地認識到,ALV-J的基因多樣性不僅存在于群體水平,在同一個體的不同臟器內(nèi)也具有很復(fù)雜的基因多樣性,并且發(fā)現(xiàn)卵泡中的病毒相比其他器官差異最大。4.ALV-J在垂直傳播過程中的演變規(guī)律前期的研究發(fā)現(xiàn)卵泡內(nèi)的ALV-J與其他器官差異很大,那么其是否可以垂直傳播到子代?子代體內(nèi)的病毒與母體哪個臟器組織關(guān)系最密切呢?針對這個問題,本研究構(gòu)建了ALV-J的垂直傳播模型,獲得了3只持續(xù)病毒血癥陽性但抗體陰性且能產(chǎn)蛋的母雞,收集它們的種蛋并孵化,分別獲得了對應(yīng)3只母雞的3只病毒血癥為陽性的雛雞。取母雞的血漿、肝臟、脾臟、腎臟、卵泡以及對應(yīng)雛雞的血漿,直接提取病毒RNA進行RT-PCR分別針對gp85的2個高變區(qū)和LTR-U3區(qū)利用Hi Seq 2500平臺進行高通量測序。分別篩選各個臟器內(nèi)的前3名優(yōu)勢突變株并分析。結(jié)果顯示,gp85-B段在子代雛雞和母雞之間出現(xiàn)了規(guī)律性演變,即在系譜進化樹分析時,子代雛雞血漿中的病毒與卵泡內(nèi)病毒第一名優(yōu)勢突變株出現(xiàn)在同一個新的分支中。同源性分析發(fā)現(xiàn),子代雛雞血漿中的病毒與母雞體內(nèi)卵泡內(nèi)的病毒的同源性最高;氨基酸序列比對也發(fā)現(xiàn)子代雛雞血漿中的病毒相比其他器官出現(xiàn)了與卵泡內(nèi)病毒相同的氨基酸位點突變。SNP分析顯示子代雛雞與母體內(nèi)病毒具有不同的突變位點。以上結(jié)果均證實了子代雛雞血漿中的病毒更可能來源于母雞卵泡內(nèi)的病毒。ALV-J在垂直傳播過程中的演變規(guī)律增加了其基因多樣性并加速了病毒的演化,從而使ALV-J更易在不同的宿主環(huán)境中生存。5.高通量測序研究ALV-J在不同感染宿主系統(tǒng)內(nèi)的演變動態(tài)作為一種典型的逆轉(zhuǎn)錄病毒,在不同易感宿主系統(tǒng)中ALV-J的演變規(guī)律很少被報道,我們所知道的是有大量不同的突變株,即具有相當大的基因多樣性的準種。本研究利用高通量測序探討了ALV-J肝臟研磨液分別接種DF-1細胞與SPF雞后的演化動態(tài)學(xué)差異。在不同的易感宿主系統(tǒng)中,從每個樣品的gp85基因的兩個高變區(qū)和LTR-U3區(qū)域分別獲得了平均約20,000條有效序列。分析發(fā)現(xiàn),在兩只雞的血漿中,大部分突變株gp85-B含有的“LSD”3肽重復(fù)插入,而其在DF-1細胞培養(yǎng)上清液中的比例僅占不到0.01%。不同易感宿主系統(tǒng)中g(shù)p85-B序列的香農(nóng)熵和全局選擇壓力值(ω)也存在顯著差異。此外,來自雞血漿、DF-1細胞和肝臟研磨液中的LTR-U3的前十名突變株有9株序列是不同的。相比DF-1細胞來自雞體的LTR-U3區(qū)發(fā)現(xiàn)更多的可引起轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件改變的突變位點。所有數(shù)據(jù)一起表明,基于病毒分離得到的ALV-J而形成的分子流行病學(xué)可能并不能代表病毒在雞群中的真正演化情況。6.ALV-J在藥物選擇壓下的變異及耐藥性的產(chǎn)生機制齊多夫定(AZT)是一種具有抗反轉(zhuǎn)錄酶活性的抗HIV藥物,而反轉(zhuǎn)錄病毒ALV也同樣具有反轉(zhuǎn)錄酶基因。之前的研究發(fā)現(xiàn)在AZT選擇作用下ALV-J產(chǎn)生了耐藥性,為了研究ALV-J在藥物選擇壓下的變異及其耐藥性的產(chǎn)生機制,將ALV-J的感染性克隆r SD1005株在含有AZT的DF-1細胞培養(yǎng)體系中連續(xù)傳代50代,耐藥試驗顯示r SD1005第50代毒株產(chǎn)生了對AZT的耐藥性,對產(chǎn)生耐藥性毒株的pol基因開展高通量測序,經(jīng)組間差異性顯著檢驗比較發(fā)現(xiàn)了一個可能與產(chǎn)生耐藥性相關(guān)的pol基因變異位點T196A(p0.05)。在感染性克隆r SD1005株基礎(chǔ)上構(gòu)建了pol基因突變的點突變株SD1005-T196A,耐藥性試驗結(jié)果顯示SD1005-T196A直接產(chǎn)生了對AZT的耐藥性,說明該位點突變與ALV耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)了ALV-J在藥物壓力下耐藥性的產(chǎn)生并確定了決定其耐藥性產(chǎn)生的pol基因關(guān)鍵核酸位點pol基因T196A,為在體內(nèi)研究逆轉(zhuǎn)錄病毒耐藥性產(chǎn)生的分子機制提供了一個可靠的病毒模型。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

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本文編號：2668728