【摘要】：沙蔥螢葉甲Galeruca daurica(Joannis)是一種近年來(lái)在內(nèi)蒙古草原上暴發(fā)成災(zāi)的新害蟲(chóng),危害沙蔥Allium mongolium、野韭Allium ramosum、多根蔥Allium polyrhizum等百合科Liliaceae蔥屬Alllim植物,嚴(yán)重破壞草原生態(tài)環(huán)境。嗅覺(jué)感受系統(tǒng)對(duì)昆蟲(chóng)的生命活動(dòng)起到了至關(guān)重要的作用,昆蟲(chóng)通過(guò)嗅覺(jué)來(lái)感知外界環(huán)境中的揮發(fā)物質(zhì),從而進(jìn)行信息交流。目前有關(guān)沙蔥螢葉甲化學(xué)感受系統(tǒng)的研究還是空白。本研究從沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組中鑒定到大量的嗅覺(jué)相關(guān)基因,并對(duì)氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白基因的表達(dá)譜和原核表達(dá)嗅覺(jué)相關(guān)蛋白與寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合特性進(jìn)行了分析,為進(jìn)一步研究沙蔥螢葉甲化學(xué)感受的分子機(jī)理奠定了必要的基礎(chǔ),并對(duì)揭示其猖厥成災(zāi)機(jī)理以及開(kāi)發(fā)利用引誘劑或驅(qū)避劑控制其發(fā)生危害具有重要的意義。主要研究結(jié)果如下:1.沙蔥螢葉甲觸角感器的顯微觀察利用掃描電子顯微鏡對(duì)沙蔥螢葉甲觸角上的感器進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明,沙蔥螢葉甲觸角感器主要有5種類型,分別是毛形感器(sensillatrichodea)、刺形感器(sensilla chaetica)、錐形感器(sensilla basiconica)、鐘形感器(sensilla campaniformia)和 Bohm 氏鬃毛(Bohm bristle)。2.沙蔥螢葉甲嗅覺(jué)相關(guān)基因的鑒定及分子特性分析從本實(shí)驗(yàn)室組裝的沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組中鑒定到66條嗅覺(jué)相關(guān)基因,包括29條氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因、10條化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因、21條嗅覺(jué)受體(olfactory receptor,OR)基因(包括1條嗅覺(jué)共同受體 olfactory receptor co-receptor,ORco)和6條感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因。序列分析結(jié)果表明,除OBP29外,其它28個(gè)OBP基因均具有完整的開(kāi)放閱讀編碼框(open reading frame,ORF),編碼氨基酸個(gè)數(shù)119～202。根據(jù)保守的半胱氨酸殘基數(shù)可將GdauOBP分為Classic OBP和Minus-C OBP兩個(gè)亞家族。10條GdauCSP基因均具有完整的ORF,編碼氨基酸個(gè)數(shù)98～273,序列中含有四個(gè)保守的半胱氨酸。GdauOR基因的ORF均不完整,編碼55～259個(gè)氨基酸。6個(gè)GdauSNMP中,GdauSNMPla和GdauSNMP1b具有完整的ORF,均含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,序列中含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基。其它4個(gè)GdauSNMP基因的ORF不完整,序列中只含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。BlastX驗(yàn)證的最佳結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析均顯示,沙蔥螢葉甲與大猿葉甲Colaphellus bowringi、榆黃毛螢葉甲Pyrrhalta maculicollis、榆綠毛螢葉甲Pyrrhaltaaenescens等鞘翅目昆蟲(chóng)嗅覺(jué)蛋白的親緣關(guān)系最近。GdauORco在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中與鱗翅目、雙翅目、半翅目、直翅目以及鞘翅目其它昆蟲(chóng)的ORco獨(dú)立地形成一支,表現(xiàn)出極度保守的進(jìn)化機(jī)制。3.沙蔥螢葉甲OBP和CSP基因的時(shí)空表達(dá)格局通過(guò)半定量和實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)沙蔥螢葉甲OBP和CSP基因的表達(dá)譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,GdauOBP和GdauCSP基因不僅表達(dá)于成蟲(chóng)觸角中,還廣泛表達(dá)于足、翅、頭、胸、腹等各部位。各基因在卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)等各發(fā)育階段也有不同程度的表達(dá)。超過(guò)一半的基因在成蟲(chóng)觸角中的表達(dá)量最高,且雌雄觸角之間的表達(dá)水平存在顯著差異。同時(shí),大多數(shù)GdauOBP和GdauCSP基因在卵和蛹中的表達(dá)水平相對(duì)較低。4.沙蔥螢葉甲OBP和CSP的克隆、原核表達(dá)及純化通過(guò) RACE 技術(shù)克隆得到 GdauOBP1、GdauOBBP6、GdauOBP10、GdauOBP20、GdauCSP4和GdauCSP5的cDNA全長(zhǎng)序列以及GdauOBP15的ORF序列和3'非編碼區(qū),驗(yàn)證了 ORF的完整性。成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)/OBP1、pET-28a(+)/OBP6、pET-28a(+)/OBP10、pET-28a(+)/OBP15、pET-28a(+)/OBP20、pET-28a(+)/CSP4和pET-28a(+)/CSP5,通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化得到了可溶性重組蛋白。5.沙蔥螢葉甲主要寄主植物揮發(fā)物的鑒定及其觸角電位反應(yīng)采用頂空動(dòng)態(tài)收集法和GC-MS技術(shù)從沙蔥螢葉甲最適寄主植物—沙蔥中鑒定出32種揮發(fā)性化合物,并從中選取了 13種主要化合物進(jìn)行EAG測(cè)定。EAG測(cè)試結(jié)果表明,二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫、二烯丙基三硫醚、順-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯和己醛7種化合物能引起沙蔥螢葉甲觸角較為強(qiáng)烈的電位反應(yīng)。此外,雌性對(duì)多數(shù)化合物的反應(yīng)值均高于雄性;當(dāng)化合物濃度在0.1 mol/L和1 mol/L時(shí),沙蔥螢葉甲的觸角電位反應(yīng)較高。6.沙蔥螢葉甲OBP和CSP與主要寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合特性熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)為探針。結(jié)果表明,GdauOBP1和GdauOBP1O對(duì)所有供試的13種寄主植物揮發(fā)物結(jié)合能力均較弱(Ki30μM);GdauOBP6與二甲基二硫醚、己醛、2-己烯醛和順-2-己烯-1-醇有較強(qiáng)的結(jié)合能力,Ki值為 25.65～29.09μM;GdauOBP15特異性地結(jié)合二甲基二硫醚,K值為23.09μM;GdauOBP20僅與對(duì)二甲苯和環(huán)庚三烯有較強(qiáng)的結(jié)合能力,Ki值分別為22.91 μM和26.55 μM。兩個(gè)CSP對(duì)寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合能力差異很大,GdauCSP4對(duì)所測(cè)化合物具有廣譜的結(jié)合能力,能與其中9種配體較好地結(jié)合,K值為12.06 μM～21.32 μM,其中結(jié)合能力最強(qiáng)的配體是苯甲酸甲酯,其次為己醛;而GdauCSP5的結(jié)合譜較窄,僅能較好地結(jié)合二甲基二硫醚和2-己烯醛,Ki值分別為26.47μM和25.28 μM。所有7個(gè)重組蛋白與二烯丙基硫醚、月桂烯和二烯丙基三硫醚的結(jié)合能力均較弱(Ki30 μM)。
【圖文】：

圖１技術(shù)路線逡逑Ｆｉｇ．Ｉ邋Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ邋ｒｏｕｔｅ逡逑

沙蔥螢葉甲CSP系統(tǒng)發(fā)育分析
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S812.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2668484