【摘要】：犢牛腹瀉是導(dǎo)致新生犢牛死亡的主要病因之一,也是造成世界范圍內(nèi)養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的原因之一。引起犢牛腹瀉的病因有很多,感染性因素被認(rèn)為是引起腹瀉的主要因素。大腸桿菌K99~+、輪狀病毒A群、冠狀病毒、隱孢子蟲這四種病原被認(rèn)為是引起犢牛腹瀉的主要病原。近年來國內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用多種方法對犢牛腹瀉主要病原分離鑒定,同時積極探索犢牛腹瀉快速診斷方法。本研究對河南省犢牛腹瀉主要病原進(jìn)行調(diào)查,同時對犢牛腹瀉微流控基因芯片進(jìn)行驗證,為本省犢牛腹瀉疾病的防控提供科學(xué)依據(jù),為犢牛腹瀉診斷提供新的技術(shù)方法。研究一:犢牛腹瀉主要病原PCR鑒定方法的建立。為建立主要病原的PCR鑒定方法,以ELISA方法作為對照。在100份犢牛腹瀉樣品中,輪狀病毒ELISA方法檢出率為15%,輪狀病毒A群PCR方法檢出率為16%。冠狀病毒ELISA方法檢出率為5%,PCR方法檢出率為7%、大腸桿菌K99~+ELISA方法檢出率為2%,PCR方法檢出率為3%。結(jié)果顯示PCR方法檢出率要高于ELISA方法,微小隱孢子蟲ELISA方法和PCR方法檢出率均為14%,但是PCR方法還鑒定出牛隱孢子蟲和瑞氏隱孢子蟲。研究二:河南省犢牛腹瀉主要病原調(diào)查。為調(diào)查河南省犢牛腹瀉病原情況,使用研究一建立的PCR方法對147份腹瀉犢牛和65份無臨床癥狀犢牛糞便樣品進(jìn)行上述四種病原篩查。在147份腹瀉樣品中隱孢子蟲陽性樣品44份,檢出率為29.93%。輪狀病毒A群陽性樣品18份,檢出率為12.24%。冠狀病毒陽性樣品7份,檢出率為4.76%。大腸桿菌K99~+陽性樣品3份,檢出率為2.04%。在65份無臨床癥狀犢牛糞便樣品中共檢出隱孢子蟲陽性樣品12份,檢出率為8.16%。輪狀病毒A群陽性樣品3份,檢出率為2.04%。未檢出冠狀病毒和大腸桿菌K99~+。在147頭腹瀉犢牛59頭犢牛為單一病原感染,12頭犢牛為兩種病原混合感染,1頭犢牛為三種病原混合感染,病原檢出有地區(qū)差異。研究三:犢牛腹瀉微流控基因芯片相關(guān)指標(biāo)驗證。為了驗證犢牛腹瀉微流控基因芯片的準(zhǔn)確性,使用微流控基因芯片對147份腹瀉犢牛糞便樣品進(jìn)行病原篩查,對微流控基因芯片上的隱孢子蟲和冠狀病毒兩個指標(biāo)進(jìn)行驗證。共檢出隱孢子蟲陽性樣本44份,冠狀病毒5份。經(jīng)過比對兩種方法陽性樣品檢出有較高的一致性。PCR方法和微流控基因芯片方法在對兩個病原檢出率無顯著差異(P0.05)。雖然在本試驗中樣品數(shù)量較少,但是通過本次試驗的對這兩個檢測指標(biāo)驗證,表明微流控基因芯片技術(shù)在犢牛腹瀉病原實驗室診斷方面有著一定的應(yīng)用價值。
【圖文】：

圖 2.6-1 隱孢子蟲凝膠電泳圖S2000 泳道（P）:陽性對照 泳道（N）:陰性對照 其余為泳道編Figure 2.6-1 Cryptosporidium gel electrophoresisM:DS2000 （P）:positive control （N）：negative controlR 陽性樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)約為 830 bp，與目標(biāo)片段一致。將測序所得到的核苷酸序列通bi.nlm.nih.gov）比對后，其中 14 個基因序列與 GeneBank 上的同源性，10 個基因序列與牛隱孢子蟲有較高的同源性，4 個高的同源性。tar MegAlign 軟件進(jìn)行序列分析（見圖 2.6-2），微小隱孢子蟲性 97%以上，微小隱孢子蟲各陽性株之間的同源性在 95%以同源性在 98%以上，，這 14 個基因片段是微小隱孢子蟲片段。蟲陽性株為：KF1、PY5、PY7、XC1、PDS1、XX2、PY9、11、PY11、PY12。蟲參考株 GeneBank 的登錄號：Cp-13（KT151548）、92（MF1

圖 2.6-2 微小隱孢子蟲核苷酸序列同源性分析Figure 2.6-2 Homology analysis of nucleotide sequences of Cryptosporidium parvum使用 DNAstar MegAlign 軟件進(jìn)行序列分析（見圖 2.6-3），10 個牛隱孢子蟲各陽性株與參考株之間的同源性 98%以上，牛隱孢子蟲各陽性株之間的同源性在 97%以上，牛隱孢子蟲陽性參考株同源性在 99%以上，這 10 個基因片段是微小隱孢子蟲片段。牛隱孢子蟲陽性株為：SMX1、SMX3、 SMX6、 SMX9、 SMX4、 SMX7、ZZ1、ZZ4、ZZ5、ZZ8。牛隱孢子蟲參考株 GeneBank 的登錄號：Chan-C90（KT922232）、151（HM002490）。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2668368