【摘要】：十二指腸賈第蟲(Giardia duodenalis),曾被稱為藍氏賈第蟲(Giardia lamblia),簡稱賈第蟲(Giardia),作為一種寄生性原蟲,主要造成人和動物腹瀉等臨床癥狀,在世界范圍內(nèi)分布流行,嚴重威脅著動物和人類健康,但目前仍缺乏有效的藥物或疫苗進行防控,究其原因主要是對賈第蟲的致病機制不完全清楚。賈第蟲作為一種“模式生物”,因此對賈第蟲相關(guān)機制的研究顯得尤為重要。寄生蟲病毒專性寄生于蟲體內(nèi),研究顯示,原蟲病毒能夠影響原蟲本身的致病性和毒力。相關(guān)報道表明賈第蟲病毒感染后能抑制賈第蟲的生長,降低賈第蟲的致病性,從而減輕賈第蟲病的臨床癥狀,雖然賈第蟲病毒的侵入可以改變賈第蟲的生長發(fā)育特征,但賈第蟲和賈第蟲病毒之間的作用機制還需要進一步的深入研究。RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)作為dsRNA病毒編碼的主要蛋白,研究表明RdRp蛋白在發(fā)揮其重要作用時,可與病毒其他成分或者宿主因子發(fā)生相互作用,但是關(guān)于十二指腸賈第蟲病毒RdRp蛋白的相關(guān)研究還相對較少。因此,本研究通過構(gòu)建賈第蟲酵母雙雜交cDNA文庫,篩選RdRp蛋白的相互作用蛋白,并利用GST pull-down、免疫共沉淀、雙分子熒光互補和Duolink?PLA技術(shù)分別驗證RdRp蛋白與互作蛋白間的相互作用。賈第蟲酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建:通過Trizol法提取賈第蟲滋養(yǎng)體(WBc2株)RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用SMART技術(shù)構(gòu)建賈第蟲酵母雙雜交c DNA質(zhì)粒文庫,結(jié)果表明構(gòu)建的文庫庫容為3.7×10~6 cfu,隨機挑取的60個單克隆菌落中插入片段在400bp~2kbp范圍內(nèi),文庫的重組率約為100%。賈第蟲病毒RdRp互作蛋白的篩選:利用基因工程技術(shù),將PCR擴增得到的賈第蟲病毒RdRp片段與誘餌載體pGBKT7重組構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-RdRp,并將誘餌載體轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細胞。結(jié)果表明該誘餌蛋白在酵母細胞中成功表達,對酵母細胞無明顯毒害作用,且無自激活現(xiàn)象。將pGBKT7-RdRp與cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化感受態(tài)篩選互作蛋白,初步篩選出與RdRp相互作用的蛋白是伴侶蛋白J,α-半乳糖苷酶試驗初步驗證了RdRp與伴侶蛋白J存在相互作用。RdRp與伴侶蛋白J相互作用的體外驗證:構(gòu)建原核表達載體pET-32a-RdRp和pGEX-4T-1-伴侶蛋白J,誘導表達并純化獲得重組蛋白,結(jié)果顯示二者均能可溶性表達蛋白,將表達純化的重組蛋白RdRp與伴侶蛋白J共孵育,通過GST pull-down技術(shù)驗證兩種蛋白在體外存在相互作用。RdRp與伴侶蛋白J在細胞內(nèi)相互作用的驗證:構(gòu)建真核表達載體pcDNA-His-RdRp和pcDNA-HA-伴侶蛋白J,共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞,Western blot檢測蛋白表達情況。結(jié)果顯示RdRp與伴侶蛋白J均能在HEK-293T細胞中表達,免疫共沉淀結(jié)果表明兩種蛋白存在相互作用。將構(gòu)建的雙分子熒光載體pbFos-RdRp和pbJun-伴侶蛋白J共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞,雙分子熒光技術(shù)驗證RdRp和伴侶蛋白J在HEK-293T細胞中存在相互作用。RdRp與伴侶蛋白J在十二指腸賈第蟲內(nèi)相互作用的驗證:制備兔源RdRp蛋白和鼠源伴侶蛋白J蛋白多抗血清,利用Duolink?PLA技術(shù)驗證RdRp和伴侶蛋白J在賈第蟲體內(nèi)的相互作用,發(fā)現(xiàn)紅色熒光主要分布在賈第蟲的細胞質(zhì)中,結(jié)果表明RdRp和伴侶蛋白J在賈第蟲內(nèi)存在相互作用。伴侶蛋白J功能的初步研究:將濃度為100μM和200μM的抑制劑KNK437分別處理賈第蟲滋養(yǎng)體,以降低伴侶蛋白J的基因表達,檢測對賈第蟲增殖和賈第蟲病毒復制的影響。表明伴侶蛋白J表達量下降后可降低賈第蟲滋養(yǎng)體的增殖以及賈第蟲病毒的拷貝數(shù),初步表明伴侶蛋白J對賈第蟲病毒RdRp具有正調(diào)節(jié)作用。綜上所述,通過構(gòu)建賈第蟲酵母雙雜交cDNA質(zhì)粒文庫初步篩選出與RdRp存在相互作用的蛋白是伴侶蛋白J,利用GST pull-down、免疫共沉淀和雙分子熒光互補技術(shù)驗證了RdRp和伴侶蛋白J的相互作用,并利用Duolink?PLA技術(shù)進一步驗證了RdRp和伴侶蛋白J在賈第蟲的細胞質(zhì)中存在相互作用,并初步研究發(fā)現(xiàn)其對賈第蟲病毒呈正調(diào)控作用,這為深入研究賈第蟲伴侶蛋白J對賈第蟲病毒的作用提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

賈第蟲滋養(yǎng)體培養(yǎng)

賈第蟲TotalRNA
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.72

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本文編號：2668351