【摘要】：十二指腸賈第蟲(chóng)(Giardia duodenalis),曾被稱(chēng)為藍(lán)氏賈第蟲(chóng)(Giardia lamblia),簡(jiǎn)稱(chēng)賈第蟲(chóng)(Giardia),作為一種寄生性原蟲(chóng),主要造成人和動(dòng)物腹瀉等臨床癥狀,在世界范圍內(nèi)分布流行,嚴(yán)重威脅著動(dòng)物和人類(lèi)健康,但目前仍缺乏有效的藥物或疫苗進(jìn)行防控,究其原因主要是對(duì)賈第蟲(chóng)的致病機(jī)制不完全清楚。賈第蟲(chóng)作為一種“模式生物”,因此對(duì)賈第蟲(chóng)相關(guān)機(jī)制的研究顯得尤為重要。寄生蟲(chóng)病毒專(zhuān)性寄生于蟲(chóng)體內(nèi),研究顯示,原蟲(chóng)病毒能夠影響原蟲(chóng)本身的致病性和毒力。相關(guān)報(bào)道表明賈第蟲(chóng)病毒感染后能抑制賈第蟲(chóng)的生長(zhǎng),降低賈第蟲(chóng)的致病性,從而減輕賈第蟲(chóng)病的臨床癥狀,雖然賈第蟲(chóng)病毒的侵入可以改變賈第蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育特征,但賈第蟲(chóng)和賈第蟲(chóng)病毒之間的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。RNA依賴(lài)RNA聚合酶(RdRp)作為dsRNA病毒編碼的主要蛋白,研究表明RdRp蛋白在發(fā)揮其重要作用時(shí),可與病毒其他成分或者宿主因子發(fā)生相互作用,但是關(guān)于十二指腸賈第蟲(chóng)病毒RdRp蛋白的相關(guān)研究還相對(duì)較少。因此,本研究通過(guò)構(gòu)建賈第蟲(chóng)酵母雙雜交cDNA文庫(kù),篩選RdRp蛋白的相互作用蛋白,并利用GST pull-down、免疫共沉淀、雙分子熒光互補(bǔ)和Duolink?PLA技術(shù)分別驗(yàn)證RdRp蛋白與互作蛋白間的相互作用。賈第蟲(chóng)酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建:通過(guò)Trizol法提取賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體(WBc2株)RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用SMART技術(shù)構(gòu)建賈第蟲(chóng)酵母雙雜交c DNA質(zhì)粒文庫(kù),結(jié)果表明構(gòu)建的文庫(kù)庫(kù)容為3.7×10~6 cfu,隨機(jī)挑取的60個(gè)單克隆菌落中插入片段在400bp~2kbp范圍內(nèi),文庫(kù)的重組率約為100%。賈第蟲(chóng)病毒RdRp互作蛋白的篩選:利用基因工程技術(shù),將PCR擴(kuò)增得到的賈第蟲(chóng)病毒RdRp片段與誘餌載體pGBKT7重組構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-RdRp,并將誘餌載體轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞。結(jié)果表明該誘餌蛋白在酵母細(xì)胞中成功表達(dá),對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)明顯毒害作用,且無(wú)自激活現(xiàn)象。將pGBKT7-RdRp與cDNA文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化感受態(tài)篩選互作蛋白,初步篩選出與RdRp相互作用的蛋白是伴侶蛋白J,α-半乳糖苷酶試驗(yàn)初步驗(yàn)證了RdRp與伴侶蛋白J存在相互作用。RdRp與伴侶蛋白J相互作用的體外驗(yàn)證:構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-RdRp和pGEX-4T-1-伴侶蛋白J,誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得重組蛋白,結(jié)果顯示二者均能可溶性表達(dá)蛋白,將表達(dá)純化的重組蛋白R(shí)dRp與伴侶蛋白J共孵育,通過(guò)GST pull-down技術(shù)驗(yàn)證兩種蛋白在體外存在相互作用。RdRp與伴侶蛋白J在細(xì)胞內(nèi)相互作用的驗(yàn)證:構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-His-RdRp和pcDNA-HA-伴侶蛋白J,共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示RdRp與伴侶蛋白J均能在HEK-293T細(xì)胞中表達(dá),免疫共沉淀結(jié)果表明兩種蛋白存在相互作用。將構(gòu)建的雙分子熒光載體pbFos-RdRp和pbJun-伴侶蛋白J共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞,雙分子熒光技術(shù)驗(yàn)證RdRp和伴侶蛋白J在HEK-293T細(xì)胞中存在相互作用。RdRp與伴侶蛋白J在十二指腸賈第蟲(chóng)內(nèi)相互作用的驗(yàn)證:制備兔源RdRp蛋白和鼠源伴侶蛋白J蛋白多抗血清,利用Duolink?PLA技術(shù)驗(yàn)證RdRp和伴侶蛋白J在賈第蟲(chóng)體內(nèi)的相互作用,發(fā)現(xiàn)紅色熒光主要分布在賈第蟲(chóng)的細(xì)胞質(zhì)中,結(jié)果表明RdRp和伴侶蛋白J在賈第蟲(chóng)內(nèi)存在相互作用。伴侶蛋白J功能的初步研究:將濃度為100μM和200μM的抑制劑KNK437分別處理賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體,以降低伴侶蛋白J的基因表達(dá),檢測(cè)對(duì)賈第蟲(chóng)增殖和賈第蟲(chóng)病毒復(fù)制的影響。表明伴侶蛋白J表達(dá)量下降后可降低賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體的增殖以及賈第蟲(chóng)病毒的拷貝數(shù),初步表明伴侶蛋白J對(duì)賈第蟲(chóng)病毒RdRp具有正調(diào)節(jié)作用。綜上所述,通過(guò)構(gòu)建賈第蟲(chóng)酵母雙雜交cDNA質(zhì)粒文庫(kù)初步篩選出與RdRp存在相互作用的蛋白是伴侶蛋白J,利用GST pull-down、免疫共沉淀和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)驗(yàn)證了RdRp和伴侶蛋白J的相互作用,并利用Duolink?PLA技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了RdRp和伴侶蛋白J在賈第蟲(chóng)的細(xì)胞質(zhì)中存在相互作用,并初步研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)賈第蟲(chóng)病毒呈正調(diào)控作用,這為深入研究賈第蟲(chóng)伴侶蛋白J對(duì)賈第蟲(chóng)病毒的作用提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體培養(yǎng)

賈第蟲(chóng)TotalRNA
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.72

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本文編號(hào)：2668351