【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種高致病力、高死亡率的接觸性傳染病。該病在我國(guó)一直流行,且以地區(qū)散發(fā)性為主;盡管各大養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)CSF給予極大的關(guān)注,但由于不科學(xué)的免疫程序、參差不齊的疫苗質(zhì)量及豬群不規(guī)范的飼養(yǎng)條件等,致使當(dāng)前CSF仍然嚴(yán)重威脅著我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)。E0、E1及E2是CSFV的三個(gè)囊膜糖蛋白,其中E2是病毒最主要的抗原蛋白,同時(shí)E2也在CSFV與宿主細(xì)胞的相互識(shí)別及吸附過程中起重要介導(dǎo)作用;因此,E2蛋白的深入研究,對(duì)于探討CSF的感染機(jī)制及新型疫苗的設(shè)計(jì)都具有重要意義。計(jì)算機(jī)輔助多肽設(shè)計(jì)技術(shù)的飛速發(fā)展,尤其是虛擬分子對(duì)接技術(shù)的廣泛應(yīng)用,為多肽篩選提供了高效的技術(shù)途徑,也使得配體與受體之間相互作用的研究更加深入�；诜肿訉�(duì)接技術(shù)的多肽虛擬篩選,不僅操作簡(jiǎn)單快捷、降低多肽篩選的強(qiáng)度及縮短研發(fā)周期,還大大地提升了篩選成功率。本研究借助虛擬分子對(duì)接技術(shù),設(shè)計(jì)多條靶向CSFVE2蛋白的親和肽,利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及等離子體共振試驗(yàn)(SPR)鑒定其親和性,之后通過體外抑制試驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗CSFV感染的活性,為深入研究E2在病毒感染中的作用提供新思路;并通過多肽與磁珠偶聯(lián),初步建立快速純化水稻表達(dá)E2蛋白的方法,為新型高效疫苗的研發(fā)提供可靠的技術(shù)支持。1豬瘟病毒E2蛋白親和肽的理性設(shè)計(jì)隨著越來越多蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)被解析,基于結(jié)構(gòu)模型的計(jì)算機(jī)輔助多肽設(shè)計(jì)技術(shù)也呈現(xiàn)快速的發(fā)展。本研究借助分子模擬對(duì)接及虛擬篩選技術(shù),組建一系列不同長(zhǎng)度的隨機(jī)多肽組合庫,將庫中的多肽與同源建模的CSFV E2蛋白上特定的位點(diǎn)實(shí)施分子對(duì)接,并通過MOLCAD模塊分析復(fù)合物的相互作用力,最后利用軟件評(píng)分系統(tǒng)對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)定與分析,設(shè)計(jì)出一系列靶向CSFV E2的親和性多肽,以期為后續(xù)的抗CSFV感染、新型疫苗設(shè)計(jì)等研究提供幫助。2豬瘟病毒E2蛋白親和肽的篩選及鑒定首先,本研究通過ELISA及SPR試驗(yàn)鑒定人工合成的多肽序列與CSFVE2蛋白相互作用的親和性及特異性;結(jié)果顯示57條多肽中有18條與E2存在不同程度的親和性結(jié)合,其中P86、P88、P708、P704、P92、P90與E2具有較高親和力,平衡解離常數(shù)(KD)值分別為 1.49nM、3.88nM、4.72nM、4.84nM、49.4nM 及 50.8nM,表明借助分子對(duì)接技術(shù)設(shè)計(jì)的靶向E2親和肽是可行的,并為后期試驗(yàn)研究提供可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)及材料。其次,將兩種不同策略GalaxyPepDock及FlexX/SYBYL給出的多肽序列評(píng)分值與其KD值的相關(guān)性進(jìn)行分析,以期驗(yàn)證全局搜索及局部搜索策略在蛋白與多肽配基對(duì)接中的重要性;結(jié)果顯示,FlexX/SYBYL預(yù)測(cè)的Cscore值與多肽KD值之間的Kendall和Spearman相關(guān)系數(shù)分別為-0.637及-0.767,呈中等程度的相關(guān)性,表明實(shí)施分子對(duì)接時(shí)采用局部搜索且充分考慮多肽的柔性要優(yōu)于全局搜索的對(duì)接策略。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)為今后多肽配基的分子設(shè)計(jì)提供合理的參考,也為蛋白質(zhì)功能解析提供有效的指導(dǎo)。3豬瘟病毒E2蛋白親和肽的抗病毒活性研究阻止病毒侵染宿主細(xì)胞是研究抗病毒感染的重要方式之一。本研究在前一章篩選到6條靶向CSFV E2高親和肽的基礎(chǔ)上,通過體外抑制試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)其抗CSFV感染的活性;病毒與多肽孵育后接種PK-15細(xì)胞,結(jié)果顯示6條多肽在一定程度上均能抑制CSFV感染,其中P88、P86及P708的抑制率高達(dá)80%以上,抑制活性最好;同時(shí),多肽封閉細(xì)胞后接種病毒,結(jié)果顯示6條多肽抗CSFV感染的活性較差,表明靶向E2的親和肽不能通過封閉受體而阻止CSFV入胞,進(jìn)一步證實(shí)親和肽的抗病毒靶點(diǎn)在病毒表面而不是細(xì)胞膜上。本試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步研究病毒受體及抗病毒藥物設(shè)計(jì)提供線索及理論依據(jù)。4親和肽在豬瘟新型疫苗前期研究中的應(yīng)用作為CSFV的免疫優(yōu)勢(shì)蛋白,E2 一直是CSFV新型亞單位疫苗研制的重點(diǎn)。本研究在前期借助分子對(duì)接技術(shù)篩選到靶向E2親和肽的基礎(chǔ)上,將其固定在磁珠上,成功從粗提水稻蛋白中純化到有效的E2蛋白,初步建立了快速純化水稻表達(dá)E2蛋白的方法;小鼠免疫抗體評(píng)價(jià)顯示,免疫劑量為l0μg和25μg的純化E2蛋白組,在接種后第14天抗體就達(dá)到陽性水平,且隨接種時(shí)間推移,呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì),到接種后第42天抗體阻斷率可高達(dá)86.18%和90.68%,刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫保護(hù)反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)照組,表明靶向E2的親和肽純化水稻表達(dá)E2蛋白是高效、可靠的。這種新的多肽設(shè)計(jì)方法為新型疫苗的設(shè)計(jì)及研發(fā)提供有力的技術(shù)支持也為蛋白多肽配基的篩選提供更為廣闊的平臺(tái)。
【圖文】：

Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｈｏｍｏｌｏｇｙ邋３Ｄ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ＣＳＦＶ邋Ｅ２逡逑ｃｈａｍＢ逡逑圖２－２邋ＣＳＦＶ邋Ｅ２邋３Ｄ結(jié)構(gòu)單體的展示逡逑注：紅色圓圈所標(biāo)示為兩個(gè)單體中ＣＳＦＶＥ２的主要抗原區(qū)域所在位置逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｍｏｎｏｍｅｒｓ邋ｏｆ邋３Ｄ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ＣＳＦＶ邋Ｅ２邋ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅ邋ａｎｔ

注：紅色圓圈所標(biāo)示為兩個(gè)單體中ＣＳＦＶＥ２的主要抗原區(qū)域所在位置逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｍｏｎｏｍｅｒｓ邋ｏｆ邋３Ｄ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ＣＳＦＶ邋Ｅ２邋ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｉｎ邋ｃｈａｉｎ邋Ａ邋ａｎｄ邋ｃｈａｉｎ邋Ｂ邋（ｅｎｃｌｏｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｒｅｄ邋ｃｉｒｃｌｅ）．逡逑１５逡逑
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651

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9 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 查紅波;豬的牛病毒性腹瀉病毒感染[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2005年

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本文編號(hào)：2668225