【摘要】：J亞群禽白血病毒(Avian leucosis virus subgroup J,ALV-J)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬,其感染后能夠在易感宿主體內(nèi)引發(fā)禽白血病,造成髓細(xì)胞瘤、血管瘤、平滑肌瘤等癥狀。該病與禽馬立克氏病、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病一樣,既屬于禽致腫瘤性疾病也屬于禽免疫抑制性疾病,給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)ALV-J致病機(jī)制的研究是防制該病的重要部分。病毒是如何入侵宿主細(xì)胞?如何突破宿主的天然免疫屏障?相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究將圍繞病毒的進(jìn)入和與宿主的相互作用開展研究,旨在深入研究禽類免疫抑制機(jī)理,尋找潛在藥物靶點(diǎn),進(jìn)一步豐富禽類反轉(zhuǎn)錄病毒研究的分子生物學(xué)信息資料,為后續(xù)的研究工作奠定基礎(chǔ)。1、膜蛋白GRP78參與ALV-J入侵宿主細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室于2015年成功發(fā)現(xiàn)一個(gè)ALV-J的新型受體chANXA2,于此同時(shí),也發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)能夠與ALV-J囊膜蛋白結(jié)合的宿主蛋白chGRP78。GRP78蛋白作為熱休克蛋白家族成員被人們所熟知,且已經(jīng)被報(bào)道在多種病毒復(fù)制中起到了關(guān)鍵作用。前期試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,用針對(duì)chGRP78的多克隆抗體封閉DF1細(xì)胞膜表面的chGRP78能夠有效抑制ALV-J的復(fù)制。為進(jìn)一步探究chGRP78功能,本研究應(yīng)用siRNA干擾技術(shù),通過對(duì)DF1細(xì)胞轉(zhuǎn)染針對(duì)chGRP78蛋白的siRNA,成功將DF1細(xì)胞中chGRP78的基因表達(dá)水平抑制了 65%。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行ALV-J感染,TCID50和Western-blot結(jié)果顯示,在降低宿主細(xì)胞chGRP78蛋白的表達(dá)后,ALV-J的感染顯著抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在ALV-J非易感細(xì)胞293T中轉(zhuǎn)染不同濃度chGRP78真核表達(dá)質(zhì)粒(0.5μg、1.5μg、3.0μg和4.5μg),結(jié)果顯示,隨著轉(zhuǎn)染chGRP78濃度的不斷增高,ALV-J入侵293T細(xì)胞的能力逐漸增強(qiáng),成明顯的正相關(guān)。為進(jìn)一步證明該結(jié)果的正確性,本研究選擇另一 ALV-J非易感的禽類細(xì)胞——鵝胚成纖維細(xì)胞(Goose embryo fibroblast,GEF),結(jié)果顯示,在GEF中轉(zhuǎn)染chGRP78后,能夠成功將非易感細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橐赘屑?xì)胞。綜上所述,chGRP78蛋白在ALV-J感染DF1細(xì)胞中發(fā)揮了重要的作用,該蛋白能夠幫助ALV-J進(jìn)入宿主細(xì)胞。2、Toll樣受體在ALV-J感染中的作用除chGRP78外,本研究特別對(duì)先天性免疫相關(guān)受體在ALV-J感染過程中發(fā)揮的作用進(jìn)行了探究。在ALV-J感染CEF細(xì)胞前16h、感染同時(shí)、感染后第12h、24h、48h和72h分別用6種禽類Toll樣受體(TLR2-5、TLR7和TLR21)對(duì)應(yīng)的配體刺激宿主細(xì)胞。同時(shí)用Real-time PCR、IFA、Westem-blot和上清中ALV-J病毒滴度進(jìn)行檢測(cè),以了解CEF細(xì)胞中ALV-J復(fù)制情況。結(jié)果顯示TLR2、TLR3和TLR4相對(duì)應(yīng)配體不管在ALV-J感染前還是感染后對(duì)CEF進(jìn)行刺激,均能夠抑制ALV-J在CEF中的復(fù)制;TLR7和TLR21配體在ALV-J感染前及感染后24h內(nèi)刺激能抑制ALV-J的復(fù)制;而TLR5配體在ALV-J感染前刺激并未影響ALV-J的復(fù)制,但在ALV-J感染同時(shí)加入TLR5配體對(duì)ALV-J復(fù)制有一定影響。綜上所述,CEF細(xì)胞的Toll樣受體被激活后,均能抑制ALV-J病毒的復(fù)制,只是刺激時(shí)間不同有所差別。這提示,從宿主細(xì)胞的角度來看,天然免疫的激活能夠抑制ALV-J的感染。而從病毒的角度來看,其在細(xì)胞中成功建立感染的過程,很可能抑制了上述某些受體信號(hào)通路。3、ALV-J感染宿主細(xì)胞CEF激活了非MyD88依賴途徑為弄清ALV-J通過抑制哪條TLR介導(dǎo)的先天免疫通路以建立感染。本研究首先用PEG-it試劑濃縮ALV-J病毒(以排除收集的病毒上清中存在某些細(xì)胞因子對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生影響),ALV-J 感染宿主細(xì)胞 CEF 后,通過 Real-time PCR 方法檢測(cè)TLR2、TLR TLR4、TLR7和TLR21在ALV-J感染后不同時(shí)間點(diǎn)被激活的情況。結(jié)果顯示,ALV-J在感染宿主細(xì)胞CEF時(shí),于感染后第72h和96h激活TLR3通路(MyD88非依賴途徑),而其余Toll樣受體(均為MyD88依賴途徑)的基因水平表達(dá)并未出現(xiàn)明顯變化。為進(jìn)一步檢驗(yàn)ALV-J感染CEF激活非MyD88途徑這一現(xiàn)象,本研究用Real-timePCR方法檢測(cè)MDA5(RIG-I通路,MyD88非依賴途徑)的表達(dá)情況,結(jié)果觀察到ALV-J感染CEF同樣能激活MDA5的上調(diào)。這一結(jié)果證明,ALV-J在感染宿主細(xì)胞CEF時(shí)主要激活MyD88非依賴途徑。同時(shí)Real-time PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示,ALV-J在感染CEF過程中能夠激活TLR3通路,同時(shí)也能夠引起IRF3/7的上調(diào)。IRF3/7作為轉(zhuǎn)錄因子處于TLR3通路的下游,說明ALV-J并未對(duì)該通路的中間環(huán)節(jié)造成抑制,然而我們發(fā)現(xiàn)ALV-J感染細(xì)胞后即使1IRF3/7基因高水平表達(dá),但并不引起TLR3信號(hào)通路下游IFN-β 和IFN-α上調(diào),也并未抑制ALV-J的復(fù)制。提示雖然宿主細(xì)胞天然免疫機(jī)制能夠識(shí)別ALV-J,但ALV-J的復(fù)制很可能通過破壞或阻礙信號(hào)通路中的某個(gè)環(huán)節(jié)(如IRF3/7功能的干擾)而發(fā)揮抗天然免疫功能。4、雞IRF3/7在抗ALV-J天然免疫中的作用IRF3/7是介導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)I型干擾素最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,其轉(zhuǎn)錄活性與生物學(xué)功能直接影響細(xì)胞的抗病毒的能力,而目前市面上并無(wú)雞IRF3/7抗體的銷售,給禽類天然免疫學(xué)的研究帶來巨大瓶頸,故本研究成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pCold-TF-chIRF3/7,將原核表達(dá)蛋白作為免疫原免疫5周齡Balb/c雄性小鼠,每隔10天免疫一次,共免疫4次,通過IFA和Westem-blot鑒定,成功制備了雞IRF3/7的多克隆抗體,為禽類天然免疫研究突破瓶頸,奠定基礎(chǔ)。同時(shí),本研究成功構(gòu)建pcDNA3.1-chIRF3/7真核表達(dá)質(zhì)粒,ALV-J感染已過表達(dá)chIRF3/7的DF1細(xì)胞,用Real-time PCR檢測(cè)ALV-J基因水平復(fù)制情況,結(jié)果顯示,chIRF3/7的過量表達(dá)可以有效抑制ALV-J的復(fù)制,且Western-blot結(jié)果、和TCID50結(jié)果均與Real-time PCR結(jié)果一致。同時(shí)chIRF3/7的過量表達(dá)也能夠明顯上調(diào)IFN-β 的上調(diào)。這一結(jié)果提示,ALV-J在感染宿主細(xì)胞的過程中有可能通過干擾chIRF3/7的功能以逃逸宿主的天然免疫。5、ALV-J Env蛋白在抗天然免疫中作用初探ALV-J與其他亞群禽白血病毒相比,其最獨(dú)特之處就是ALV-J的Env基因,該基因其他亞群之間的同源性極低。且有學(xué)者提出ALV-J Env蛋白致病致瘤理論。由此推測(cè),ALV-J Env蛋白在抗天然免疫中是否也發(fā)揮一定的作用。本研究成功構(gòu)建pcDNA3.1-Env真核表達(dá)質(zhì)粒以研究Env蛋白的功能。Real-time PCR結(jié)果與雙熒光報(bào)告素酶結(jié)果顯示,Env蛋白能夠在poly(I:C)刺激后lh、6h和12h抑制IFN-β的表達(dá)。Real-timePCR結(jié)果顯示,在poly(I:C)刺激12h時(shí),TLR3基因表達(dá)水平上調(diào),但是IRF3/7和IFN-β3都是處于下調(diào)的狀態(tài)。提示Env蛋白在ALV-J抗天然免疫中可能發(fā)揮作用,且Env蛋白發(fā)揮作用可能與IRF3/7功能被干擾相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王增福;崔治中;;在抗體免疫選擇壓作用下雞J亞群白血病病毒gp85基因的變異[J];中國(guó)科學(xué)C輯:生命科學(xué);2006年01期

2 秦愛建,劉岳龍,周綺雯,黃維嘉;J亞群禽白血病病毒的免疫熒光檢測(cè)效果[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2001年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 葉建強(qiáng);J亞群禽白血病病毒Env蛋白分子生物學(xué)特性研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2005年

，

本文編號(hào)：2668105