【摘要】：本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),uPA與錨定于自身細(xì)胞膜外的uPAR結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。為了深入了解uPA與uPAR調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)牛卵丘顆粒細(xì)胞增殖的具體機(jī)制,本研究綜合細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞增殖、Western bot、ELISA等多種技術(shù),探討了uPA、uPAR、cAMP和磷酸化ERK與AKT表達(dá)在牛卵丘顆粒細(xì)胞增殖過(guò)程中可能的互作機(jī)制。研究結(jié)果顯示,(1)0.5ng/mL uPA分別作用不同時(shí)間2、5、10、20、30min后,5 min處理組顯示最高的ERK與AKT磷酸化水平,均極顯著高于對(duì)照組(P0.01);聯(lián)合添加0.5 ng/mL uPA與1μg/mL Amiloride處理5 min后,與uPA組相比,聯(lián)合添加組(uPA+Amiloride)中磷酸化ERK與AKT表達(dá)量極顯著降低(P0.01),說(shuō)明Amiloride能夠明顯抑制uPA對(duì)牛卵丘顆粒細(xì)胞中磷酸化ERK與AKT表達(dá)的促進(jìn)作用。(2)聯(lián)合添加0.5 ng/mL uPA與10μL/mLuPAR抗體繼續(xù)培養(yǎng)5 min后,與uPA組相比,聯(lián)合添加組(uPA+uPAR抗體)的磷酸化ERK與AKT極顯著降低(P0.01),說(shuō)明uPA與其受體uPAR結(jié)合后,能夠激活ERK與AKT信號(hào)。(3)聯(lián)合添加uPA與Amiloride或者uPA與uPAR抗體分別培養(yǎng)5 min后,與對(duì)照組比較,添加uPA組能顯著上調(diào)cAMP水平(P0.01);與uPA組相比,聯(lián)合添加組(uPA+Amiloride或uPA+uPAR抗體)極顯著下調(diào)了cAMP水平(P0.01),說(shuō)明Amiloride能夠抵消uPA對(duì)卵丘顆粒細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的提升作用,而此過(guò)程與uPAR相關(guān)。(4)聯(lián)合添加0.5μM Rp-cAMP與uPA培養(yǎng)5 min后,與uPA組相比,聯(lián)合添加組(uPA+Rp-cAMP)的磷酸化ERK與AKT表達(dá)量極顯著降低(P0.01),說(shuō)明uPA通過(guò)上調(diào)cAMP水平,刺激PKA信號(hào)通路,進(jìn)而激活下游ERK與AKT磷酸化過(guò)程。(5)聯(lián)合添加Rp-cAMP與uPA培養(yǎng)48 h后,與uPA組相比,聯(lián)合添加組(uPA+Rp-cAMP)中卵丘顆粒細(xì)胞數(shù)量極顯著降低(P0.01),說(shuō)明Rp-cAMP能夠抵消uPA對(duì)卵丘顆粒細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用。綜上所述,本研究揭示了uPA與uPAR調(diào)節(jié)牛卵丘顆粒細(xì)胞增殖的信號(hào)機(jī)制:uPA結(jié)合卵丘顆粒細(xì)胞膜上受體uPAR,上調(diào)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,激活PKA通路,使下游ERK與AKT被磷酸化,最終促進(jìn)體外培養(yǎng)的牛卵丘顆粒細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果對(duì)于深入理解牛卵泡發(fā)育調(diào)控機(jī)制,具有重要意義。
【圖文】：

果與分析的培養(yǎng)及生長(zhǎng)狀態(tài)接接種貼壁的方法進(jìn)行培養(yǎng)牛卵丘顆粒細(xì)胞。原代培養(yǎng)牛卵丘顆 1×105個(gè)/mL 進(jìn)行接種到 25 cm2培養(yǎng)瓶中，，12-24 h 后觀察到細(xì)胞形變成長(zhǎng)梭形，向兩頭伸展成長(zhǎng)梭形；2-3 d 后，細(xì)胞逐漸呈長(zhǎng)條開(kāi)始匯合。4 d 后卵丘顆粒細(xì)胞大量貼壁生長(zhǎng)，部分細(xì)胞變成多長(zhǎng)滿瓶底，基本匯合成單層，細(xì)胞基本呈現(xiàn)不規(guī)則的多邊形，之細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中匯合達(dá)到 80%左右，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培血清的 DMED 中生長(zhǎng)旺盛，6 h 即可見(jiàn)到細(xì)胞貼壁。在早期(1現(xiàn)出長(zhǎng)梭形，偶爾也會(huì)出現(xiàn)多邊形(見(jiàn)圖 1)。

圖 2 添加 uPA 處理不同時(shí)間后對(duì)培養(yǎng)牛卵丘顆粒細(xì)胞中 ERK1/2 磷酸化表達(dá)的影響ERK1/2 和 p-ERK1/2 熒光條帶(A)，p-ERK/ERK 熒光分析值（B）�！�**”代表差異極顯著（P<0.01）。Fig.2 Effect of uPA with different treating periods of 0, 2, 5 10,20 and30 mins on ERK1/2 phosphorylatioof bovine cumulus granulosa cells cultured. Immunoreactive bands corresponding to active ERK1/2 andp-ERK1/2is indicated as A , p-ERK/ERK value as B.“**”presents the significant difference (P<0.01).
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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2 金艷梅;;顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡發(fā)育的影響[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2010年08期

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本文編號(hào)：2667952