【摘要】：偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacterium pseudotuberulosis,C.p)是一種人畜共患病原菌,在養(yǎng)殖業(yè)中能對(duì)多種動(dòng)物感染,其中以羊的感染最為多見(jiàn),能夠引起羊干酪性淋巴結(jié)炎(Caseous lymphadenitis,CLA),在國(guó)內(nèi)外均有其流行報(bào)道。羊群感染偽結(jié)核棒狀桿菌后,常不致死,多呈慢性經(jīng)過(guò),病羊表現(xiàn)為漸近性消瘦、被毛粗亂、局部干酪樣膿腫病變等癥狀,除影響皮毛、肉制品、乳制品質(zhì)量和降低其經(jīng)濟(jì)價(jià)值外,還能夠威脅公共衛(wèi)生安全,已經(jīng)對(duì)世界養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展造成較大損失。近年來(lái),在我國(guó)畜牧業(yè)快速發(fā)展的同時(shí),羊干酪性淋巴結(jié)炎也在我國(guó)多省份出現(xiàn)流行,其中山羊發(fā)病報(bào)道多于綿羊,且有更加嚴(yán)重的流行趨勢(shì)。羊干酪性淋巴結(jié)炎發(fā)病數(shù)量逐漸增多,但目前對(duì)該病原及防控方法研究較少。本研究在陜西寶雞和銅川兩地的關(guān)中奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)中,采集干酪性淋巴結(jié)炎發(fā)病羊膿腫組織病料,通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)方法獲得疑似偽結(jié)核棒狀桿菌菌株兩株,對(duì)其進(jìn)行了挑純、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、分子生物學(xué)鑒定和動(dòng)物致病性試驗(yàn);對(duì)分離鑒定的兩株偽結(jié)核棒狀桿菌LX1和TC11菌株進(jìn)行體外連續(xù)傳代培養(yǎng),用兩株細(xì)菌的原代、50代、100代、150代和200代菌株分別進(jìn)行小鼠致病性試驗(yàn),同時(shí)使用致弱效果較好菌株的200代菌株注射小鼠14 d后,用致病性較強(qiáng)的原代菌株進(jìn)行攻菌試驗(yàn),以研究傳代致弱方法對(duì)開(kāi)發(fā)弱毒疫苗的可行性;為開(kāi)發(fā)類毒素疫苗,將表達(dá)的毒素磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)用5%的甲醛(V/V),室溫作用48 h進(jìn)行滅活制成類毒素制劑,分別免疫小鼠和兩批山羊,用間接ELISA測(cè)免疫后30 d、90 d和150 d山羊血清抗體。試驗(yàn)結(jié)果如下:1.分離菌株LX1和TC11經(jīng)37℃培養(yǎng)48 h后,在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基不生長(zhǎng),在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)貧瘠,鮮血瓊脂培養(yǎng)基上可見(jiàn)乳白色、干燥、易于刮落、不透明、邊緣較整齊,直徑約1 mm~2 mm的菌落。革蘭氏染色陽(yáng)性,呈球狀、球桿狀或棒狀,生化試驗(yàn)和16S rRNA的PCR鑒定結(jié)果確定分離菌株為偽結(jié)核棒狀桿菌,且兩株分離菌株均能使小鼠死亡或注射部位引發(fā)干酪樣膿腫病變;藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,兩菌株對(duì)磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)脂類等抗生素均敏感,多粘菌素均耐藥。2.LX1和TC11菌株的原代與第50、100、150和200代菌株接種小鼠后7 d內(nèi),LX1原代菌株注射的小鼠死亡2只,未死亡小鼠注射部位膿腫病變區(qū)域平均直徑為8.7mm,傳代菌株注射小鼠均未死亡,病變平均直徑分別為4.6 mm、2.6 mm、1.4 mm和1 mm;TC11原代菌株注射的小鼠死亡2只,未死亡小鼠平均病變直徑為9.3 mm,傳代菌株注射小鼠均未死亡,病變平均直徑分別為5.4 mm、2.8 mm、1.8 mm和1.4 mm。LX1第200代菌株接種小鼠14 d后攻菌,10只實(shí)驗(yàn)組小鼠無(wú)死亡個(gè)體,平均膿腫直徑為2.0 mm,10只對(duì)照組小鼠死亡4只,未死亡小鼠平均膿腫直徑為7.8 mm;3.類毒素免疫試驗(yàn)中,攻菌7 d內(nèi),試驗(yàn)組小鼠10只均未死亡,1只小鼠發(fā)病,保護(hù)率為90%(9/10),對(duì)照組小鼠死亡4只,剩余6只全部發(fā)病;羊群預(yù)實(shí)驗(yàn)中,90 d內(nèi)實(shí)驗(yàn)組干酪性淋巴結(jié)炎發(fā)病1頭,病原為金黃色葡萄球菌;對(duì)照組發(fā)生干酪性淋巴結(jié)炎3頭,分離到偽結(jié)核棒狀桿菌兩株;羊群大規(guī)模免疫試驗(yàn)中,150 d內(nèi)實(shí)驗(yàn)組干酪性淋巴結(jié)炎發(fā)病羊?yàn)?頭,分離到1株偽結(jié)核棒狀桿菌,偽結(jié)核棒狀桿菌感染率為0.9%(1/114),對(duì)照組干酪性淋巴結(jié)炎發(fā)病羊23頭,分離到9株偽結(jié)核棒狀桿菌,偽結(jié)核棒狀桿菌感染率為7.9%(9/114);免疫羊血清OD_(450)檢測(cè)結(jié)果表明,在免疫后30 d內(nèi)抗體水平最高,而后呈下降趨勢(shì),在150 d時(shí)接近陽(yáng)性血清臨界值。以上研究結(jié)果證實(shí),連續(xù)傳代的方法可有將偽結(jié)核棒狀桿菌毒力致弱,為偽結(jié)核棒狀桿菌弱毒疫苗開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ);羊偽結(jié)核棒狀桿菌類毒素疫苗能夠?yàn)槊庖咝∈蠛兔庖哐蛑惶峁┮欢ǖ拿庖弑Ｗo(hù),但存在免疫有效期短的問(wèn)題,需要后期研究延長(zhǎng)免疫有效期。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：2665923