【摘要】：偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacterium pseudotuberulosis,C.p)是一種人畜共患病原菌,在養(yǎng)殖業(yè)中能對多種動物感染,其中以羊的感染最為多見,能夠引起羊干酪性淋巴結(jié)炎(Caseous lymphadenitis,CLA),在國內(nèi)外均有其流行報道。羊群感染偽結(jié)核棒狀桿菌后,常不致死,多呈慢性經(jīng)過,病羊表現(xiàn)為漸近性消瘦、被毛粗亂、局部干酪樣膿腫病變等癥狀,除影響皮毛、肉制品、乳制品質(zhì)量和降低其經(jīng)濟價值外,還能夠威脅公共衛(wèi)生安全,已經(jīng)對世界養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展造成較大損失。近年來,在我國畜牧業(yè)快速發(fā)展的同時,羊干酪性淋巴結(jié)炎也在我國多省份出現(xiàn)流行,其中山羊發(fā)病報道多于綿羊,且有更加嚴重的流行趨勢。羊干酪性淋巴結(jié)炎發(fā)病數(shù)量逐漸增多,但目前對該病原及防控方法研究較少。本研究在陜西寶雞和銅川兩地的關(guān)中奶山羊養(yǎng)殖場中,采集干酪性淋巴結(jié)炎發(fā)病羊膿腫組織病料,通過細菌分離培養(yǎng)方法獲得疑似偽結(jié)核棒狀桿菌菌株兩株,對其進行了挑純、染色鏡檢、生化試驗、分子生物學(xué)鑒定和動物致病性試驗;對分離鑒定的兩株偽結(jié)核棒狀桿菌LX1和TC11菌株進行體外連續(xù)傳代培養(yǎng),用兩株細菌的原代、50代、100代、150代和200代菌株分別進行小鼠致病性試驗,同時使用致弱效果較好菌株的200代菌株注射小鼠14 d后,用致病性較強的原代菌株進行攻菌試驗,以研究傳代致弱方法對開發(fā)弱毒疫苗的可行性;為開發(fā)類毒素疫苗,將表達的毒素磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)用5%的甲醛(V/V),室溫作用48 h進行滅活制成類毒素制劑,分別免疫小鼠和兩批山羊,用間接ELISA測免疫后30 d、90 d和150 d山羊血清抗體。試驗結(jié)果如下:1.分離菌株LX1和TC11經(jīng)37℃培養(yǎng)48 h后,在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基不生長,在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長貧瘠,鮮血瓊脂培養(yǎng)基上可見乳白色、干燥、易于刮落、不透明、邊緣較整齊,直徑約1 mm~2 mm的菌落。革蘭氏染色陽性,呈球狀、球桿狀或棒狀,生化試驗和16S rRNA的PCR鑒定結(jié)果確定分離菌株為偽結(jié)核棒狀桿菌,且兩株分離菌株均能使小鼠死亡或注射部位引發(fā)干酪樣膿腫病變;藥敏試驗結(jié)果表明,兩菌株對磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)脂類等抗生素均敏感,多粘菌素均耐藥。2.LX1和TC11菌株的原代與第50、100、150和200代菌株接種小鼠后7 d內(nèi),LX1原代菌株注射的小鼠死亡2只,未死亡小鼠注射部位膿腫病變區(qū)域平均直徑為8.7mm,傳代菌株注射小鼠均未死亡,病變平均直徑分別為4.6 mm、2.6 mm、1.4 mm和1 mm;TC11原代菌株注射的小鼠死亡2只,未死亡小鼠平均病變直徑為9.3 mm,傳代菌株注射小鼠均未死亡,病變平均直徑分別為5.4 mm、2.8 mm、1.8 mm和1.4 mm。LX1第200代菌株接種小鼠14 d后攻菌,10只實驗組小鼠無死亡個體,平均膿腫直徑為2.0 mm,10只對照組小鼠死亡4只,未死亡小鼠平均膿腫直徑為7.8 mm;3.類毒素免疫試驗中,攻菌7 d內(nèi),試驗組小鼠10只均未死亡,1只小鼠發(fā)病,保護率為90%(9/10),對照組小鼠死亡4只,剩余6只全部發(fā)病;羊群預(yù)實驗中,90 d內(nèi)實驗組干酪性淋巴結(jié)炎發(fā)病1頭,病原為金黃色葡萄球菌;對照組發(fā)生干酪性淋巴結(jié)炎3頭,分離到偽結(jié)核棒狀桿菌兩株;羊群大規(guī)模免疫試驗中,150 d內(nèi)實驗組干酪性淋巴結(jié)炎發(fā)病羊為8頭,分離到1株偽結(jié)核棒狀桿菌,偽結(jié)核棒狀桿菌感染率為0.9%(1/114),對照組干酪性淋巴結(jié)炎發(fā)病羊23頭,分離到9株偽結(jié)核棒狀桿菌,偽結(jié)核棒狀桿菌感染率為7.9%(9/114);免疫羊血清OD_(450)檢測結(jié)果表明,在免疫后30 d內(nèi)抗體水平最高,而后呈下降趨勢,在150 d時接近陽性血清臨界值。以上研究結(jié)果證實,連續(xù)傳代的方法可有將偽結(jié)核棒狀桿菌毒力致弱,為偽結(jié)核棒狀桿菌弱毒疫苗開發(fā)奠定理論基礎(chǔ);羊偽結(jié)核棒狀桿菌類毒素疫苗能夠為免疫小鼠和免疫羊只提供一定的免疫保護,但存在免疫有效期短的問題,需要后期研究延長免疫有效期。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61

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