發(fā)布時(shí)間：2020-05-16 03:05

【摘要】：馬立克病病毒(MDV)是少數(shù)感染自然宿主后可誘發(fā)淋巴瘤的皰疹病毒之一,是研究腫瘤發(fā)生及發(fā)展的理想動(dòng)物模型。目前已報(bào)道MDV可編碼數(shù)十種miRNA,其中MDV-1編碼的miR-M4-5p被鑒定為宿主細(xì)胞miR-155的同源物,由于miR-155與人類多種腫瘤性疾病密切相關(guān),這意味著miR-M4-5p可能在MDV的致瘤過程中扮演重要角色。本研究旨在構(gòu)建miR-M4-5p的宿主靶基因文庫并進(jìn)行初步鑒定。提取雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用hybrid-PCR擴(kuò)增候選靶基因片段連接到pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞后挑選單克隆進(jìn)行PCR鑒定及測序,通過BLAST比對(duì)分析,共獲得88個(gè)宿主候選靶基因序列。優(yōu)先選擇miRNA結(jié)合靶點(diǎn)位于mRNA 3′-UTR且與miR-M4-5p種子序列(2~7nt)完全互補(bǔ)配對(duì)的29個(gè)候選靶基因,構(gòu)建報(bào)告基因載體進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn),通過三輪雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)最終初步鑒定5個(gè)宿主靶基因:PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1,為進(jìn)一步揭示miR-M4-5p的分子調(diào)控機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。
【圖文】：

ＬＬＡＲＩＩ，，輕柔混合均勻后用Ω酶標(biāo)儀（ＯＭＧＬａｂｔｅｃｈ）測定螢火蟲熒光素酶數(shù)值。最后向每孔加入１００μＬＳｔｏｐａｎｄＧｌｏＲｅａｇｅｎｔ，輕柔混合均勻后，同上測定海腎熒光素酶數(shù)值。最后統(tǒng)計(jì)分析海腎熒光素酶／螢火蟲熒光素酶活性比值。２結(jié)果２．１ｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ宿主候選靶基因ｃＤＮＡ文庫的構(gòu)建將ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ產(chǎn)物電泳分析后割膠回收（圖１），連接ｐＭＤ１９－Ｔ載體，轉(zhuǎn)化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９后鋪板培Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒ圖１Ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ特異性引物示意圖（Ａ）和ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ產(chǎn)物電泳分析（Ｂ）Ｆｉｇ．１ＳｃｈｅｍａｔｉｃｏｆｍｉＲ－Ｍ４－５ｐｈｙｂｒｉｄｐｒｉｍｅｒ（Ａ）ａｎｄａｇａｒ－ｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂ）３５２

２）。其中，結(jié)合位點(diǎn)在３′－ＵＴＲ的基因有６３個(gè)，結(jié)合位點(diǎn)在ＣＤＳ的基因有２０個(gè)，結(jié)合位點(diǎn)在５′－ＵＴＲ的基因有５個(gè)。結(jié)合位點(diǎn)在３′－ＵＴＲ的６３個(gè)基因中有２９個(gè)基因的結(jié)合位點(diǎn)與ｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ的種子區(qū)完全互補(bǔ)（包括Ｇ：Ｕ）。我們優(yōu)先選擇這２９個(gè)基因進(jìn)行下一步的ＤＬＲＡ試驗(yàn)分析。Ｍ．ＤＮＡ相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；１～１２．菌液克隆號(hào)Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１－１２．Ｃｌｏｎｅｎｕｍｂｅｒｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｆｌｕｉｄ圖２Ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ產(chǎn)物的部分菌液ＰＣＲ產(chǎn)物電泳分析Ｆｉｇ．２Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｒｔｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ表２ｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ靶標(biāo)文庫候選基因列表Ｔａｂｌｅ２ＰｕｔａｔｉｖｅｔａｒｇｅｔｍＲＮＡｓｏｆｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ編號(hào)Ｎｏ．基因Ｇｅｎｅ結(jié)合位置Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ編號(hào)Ｎｏ．基因Ｇｅｎｅ結(jié)合位置Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ編號(hào)Ｎｏ．基因Ｇｅｎｅ結(jié)合位置Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ１ＣＳＮＫ２Ａ２３′－ＵＴＲ３１ＲＡＣ１３′－ＵＴＲ６１ＰＰＭ１Ｅ３′－ＵＴＲ２ＰＤＫ３３′－ＵＴＲ３２ＲＢＭ２４３′－ＵＴＲ６２ＰＣＹＴ１Ａ３′－ＵＴＲ３ＰＲＩＣＫＬＥ１３′－ＵＴＲ３３ＦＫＢＰ７３′－ＵＴＲ６３ＳＬＣ１２Ａ４３′－ＵＴＲ４ＳＥＰＴ２３′－ＵＴＲ３４ＭＡＲＣＫＳ３′－ＵＴＲ６４ＲＰＬ２７ＣＤＳ５ＰＰＦＩＢＰ１３′－ＵＴＲ３５ＮＤＦＩＰ１３′－ＵＴＲ６５ＲＰＬ１２ＣＤＳ６ＣＯＬＡ３′－ＵＴＲ３６ＳＴ５３′－ＵＴＲ６６ＣＣＴ２Ｃ

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