【摘要】：馬立克病病毒(MDV)是少數(shù)感染自然宿主后可誘發(fā)淋巴瘤的皰疹病毒之一,是研究腫瘤發(fā)生及發(fā)展的理想動物模型。目前已報道MDV可編碼數(shù)十種miRNA,其中MDV-1編碼的miR-M4-5p被鑒定為宿主細胞miR-155的同源物,由于miR-155與人類多種腫瘤性疾病密切相關,這意味著miR-M4-5p可能在MDV的致瘤過程中扮演重要角色。本研究旨在構建miR-M4-5p的宿主靶基因文庫并進行初步鑒定。提取雞胚成纖維細胞(CEF)總RNA,反轉錄合成cDNA,用hybrid-PCR擴增候選靶基因片段連接到pMD19-T載體,轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后挑選單克隆進行PCR鑒定及測序,通過BLAST比對分析,共獲得88個宿主候選靶基因序列。優(yōu)先選擇miRNA結合靶點位于mRNA 3′-UTR且與miR-M4-5p種子序列(2~7nt)完全互補配對的29個候選靶基因,構建報告基因載體進行雙熒光素酶報告試驗,通過三輪雙熒光素酶報告試驗最終初步鑒定5個宿主靶基因:PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1,為進一步揭示miR-M4-5p的分子調控機制奠定了重要基礎。
【圖文】：

ＬＬＡＲＩＩ，，輕柔混合均勻后用Ω酶標儀（ＯＭＧＬａｂｔｅｃｈ）測定螢火蟲熒光素酶數(shù)值。最后向每孔加入１００μＬＳｔｏｐａｎｄＧｌｏＲｅａｇｅｎｔ，輕柔混合均勻后，同上測定海腎熒光素酶數(shù)值。最后統(tǒng)計分析海腎熒光素酶／螢火蟲熒光素酶活性比值。２結果２．１ｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ宿主候選靶基因ｃＤＮＡ文庫的構建將ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ產物電泳分析后割膠回收（圖１），連接ｐＭＤ１９－Ｔ載體，轉化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９后鋪板培Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒ圖１Ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ特異性引物示意圖（Ａ）和ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ產物電泳分析（Ｂ）Ｆｉｇ．１ＳｃｈｅｍａｔｉｃｏｆｍｉＲ－Ｍ４－５ｐｈｙｂｒｉｄｐｒｉｍｅｒ（Ａ）ａｎｄａｇａｒ－ｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂ）３５２

２）。其中，結合位點在３′－ＵＴＲ的基因有６３個，結合位點在ＣＤＳ的基因有２０個，結合位點在５′－ＵＴＲ的基因有５個。結合位點在３′－ＵＴＲ的６３個基因中有２９個基因的結合位點與ｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ的種子區(qū)完全互補（包括Ｇ：Ｕ）。我們優(yōu)先選擇這２９個基因進行下一步的ＤＬＲＡ試驗分析。Ｍ．ＤＮＡ相對分子質量標準；１～１２．菌液克隆號Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１－１２．Ｃｌｏｎｅｎｕｍｂｅｒｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｆｌｕｉｄ圖２Ｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲ產物的部分菌液ＰＣＲ產物電泳分析Ｆｉｇ．２Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｒｔｈｙｂｒｉｄ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ表２ｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ靶標文庫候選基因列表Ｔａｂｌｅ２ＰｕｔａｔｉｖｅｔａｒｇｅｔｍＲＮＡｓｏｆｍｉＲ－Ｍ４－５ｐ編號Ｎｏ．基因Ｇｅｎｅ結合位置Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ編號Ｎｏ．基因Ｇｅｎｅ結合位置Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ編號Ｎｏ．基因Ｇｅｎｅ結合位置Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ１ＣＳＮＫ２Ａ２３′－ＵＴＲ３１ＲＡＣ１３′－ＵＴＲ６１ＰＰＭ１Ｅ３′－ＵＴＲ２ＰＤＫ３３′－ＵＴＲ３２ＲＢＭ２４３′－ＵＴＲ６２ＰＣＹＴ１Ａ３′－ＵＴＲ３ＰＲＩＣＫＬＥ１３′－ＵＴＲ３３ＦＫＢＰ７３′－ＵＴＲ６３ＳＬＣ１２Ａ４３′－ＵＴＲ４ＳＥＰＴ２３′－ＵＴＲ３４ＭＡＲＣＫＳ３′－ＵＴＲ６４ＲＰＬ２７ＣＤＳ５ＰＰＦＩＢＰ１３′－ＵＴＲ３５ＮＤＦＩＰ１３′－ＵＴＲ６５ＲＰＬ１２ＣＤＳ６ＣＯＬＡ３′－ＵＴＲ３６ＳＴ５３′－ＵＴＲ６６ＣＣＴ２Ｃ

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